Les pesticides jouent un rôle crucial dans la lutte contre les pénuries alimentaires mondiales et les maladies vectorielles humaines. Cependant, le problème croissant de la résistance aux pesticides exige la découverte urgente de nouvelles molécules ciblant des mécanismes sous-exploités. Les canaux TRPV (Transient Receptor Potential) des insectes – Nanzhong (Nan) et inactif (Iav) – peuvent former des canaux hétérologues (Nan-Iav) et se localiser dans les organes mécanosensoriels impliqués dans le géotropisme, l'ouïe et la proprioception chez les insectes. Certains pesticides, comme l'aphidopyrrolidone (AP), ciblent Nan-Iav par des mécanismes encore inconnus. L'AP est efficace contre les insectes piqueurs-suceurs (hémiptères), empêchant leur alimentation par perturbation du fonctionnement des filaments. L'AP se lie uniquement à Nan, mais seul Nan-Iav peut interagir avec des agonistes, notamment la nicotinamide endogène (NAM), et ainsi présenter une activité de canal. Malgré le potentiel de Nan-Iav comme cible insecticide, son assemblage en canal, ses sites de liaison régulateurs et sa régulation dépendante du Ca²⁺ restent mal connus, ce qui freine le développement d'insecticides. Dans cette étude, la cryo-microscopie électronique a été utilisée pour déterminer la structure de Nan-Iav chez les hémiptères, à l'état dépourvu de ligand (calmoduline), ainsi qu'en présence d'AP et de NAM à la limite du domaine cytoplasmique à répétitions d'ankyrine (ARD). De façon surprenante, nous avons découvert que la protéine Nan peut former un pentamère, stabilisé par des interactions ARD médiées par AP. Cette étude révèle des interactions moléculaires entre les insecticides, les agonistes et Nan-Iav, soulignant l'importance de l'ARD dans la fonction et l'assemblage du canal, et explorant le mécanisme de régulation par le Ca²⁺.
Dans un contexte de changements climatiques mondiaux de plus en plus graves, la détérioration de la sécurité alimentaire mondiale est l'un des défis majeurs du XXIe siècle, avec des conséquences en cascade pour la société.1,2Le rapport de l'Organisation mondiale de la santé intitulé « État de la sécurité alimentaire et de la nutrition dans le monde 2023 (SOFI) » estime qu'environ 2,33 milliards de personnes dans le monde souffrent d'insécurité alimentaire modérée à grave, un problème persistant.3,4Malheureusement, on estime que 20 à 30 % des récoltes, voire plus, sont perdues chaque année à cause des ravageurs et des agents pathogènes, et le réchauffement climatique devrait aggraver la résistance des ravageurs et la vulnérabilité des cultures.4, 5, 6, 7, 8Le développement de pesticides est essentiel non seulement pour protéger les cultures contre les ravageurs et réduire la propagation des agents pathogènes transmis par des vecteurs, mais aussi pour lutter contre les maladies humaines transmises par des vecteurs telles que la dengue, le paludisme et la maladie de Chagas, qui sont de plus en plus résistantes aux pesticides.5, 9, 10, 11
Parmi les principales cibles des insecticides neurotoxiques, le canal hétérotétramérique TRPV Nanchung (Nan)-Inactif (Iav) représente une classe de cibles d'insecticides découvertes seulement au cours de la dernière décennie, y compris des insecticides disponibles dans le commerce tels que l'imidaclopride et le pyraclostrobine.12, 13, 14L'insecticide semi-synthétique aphidopyrrolifen (AP) est un produit récemment développé et commercialisé dont le principal composant est l'insecticide actif Inscalis®, qui lie l'AP à un niveau d'activité subnanomolaire.15L'AP présente une faible toxicité aiguë pour les pollinisateurs, les insectes bénéfiques et autres organismes non ciblés, et lorsqu'il est utilisé conformément aux instructions figurant sur l'étiquette, il peut réduire la pression de résistance aux autres insecticides.16, 17, 18Nan et Iav sont largement répandus chez les insectes, ne sont co-exprimés que dans les neurones récepteurs d'étirement des cordes des antennes et des membres, et sont essentiels pour l'ouïe, la perception de la gravité et la proprioception.13, 16, 19, 20, 21, 22L'AP, l'imidaclopride et le pyraclostrobine stimulent le complexe Nan-Iav par un mécanisme unique, inhibant finalement la transduction du signal proprioceptif.13, 16, 23Chez les insectes piqueurs-suceurs (hémiptères) tels que les pucerons et les aleurodes, la perte de proprioception altère leur capacité à se nourrir, ce qui conduit finalement à la mort.13,24Il est intéressant de noter que la phosphatase alcaline (AP) présente une forte affinité pour le complexe Nan-Iav et une faible affinité pour Nan seul. La liaison de l'AP au complexe Nan-Iav induit un courant électrique, tandis que sa liaison à Nan seul ne stimule pas l'activité du canal. Iav, quant à lui, ne se lie pas du tout à l'AP.16Cela suggère que Nan et Iav pourraient se lier pour former différents complexes de canaux Nan-Iav (par exemple, avec des rapports stœchiométriques différents ou des arrangements différents au sein d'un même rapport stœchiométrique) ou que AP pourrait se lier à plusieurs sites. De plus, l'agoniste naturel nicotinamide (NAM) se lie à Nan-Iav de la drosophile avec une affinité micromolaire, présentant des effets similaires à ceux des pucerons (AP) in vitro16,25et en inhibant la reproduction et l'alimentation des pucerons, ce qui conduit finalement à leur mort25,26Ces données soulèvent de nombreuses questions. Par exemple, le mécanisme de formation de l'hétérodimère Nan-Iav, les sites de liaison impliqués dans la modulation des petites molécules et la manière dont ces molécules régulent la fonction du canal en inhibant la proprioception restent inconnus. De plus, les raisons pour lesquelles Nan est inactif et présente une faible affinité pour le potentiel d'action (PA), tandis que l'hétérodimère Nan-Iav est actif et se lie au PA avec une affinité plus élevée, demeurent obscures. Enfin, la régulation de la fonction de Nan-Iav par le Ca2+ et son intégration dans les processus de signalisation neuronale sont encore mal connues.. 13,21
Dans cette étude, combinant la cryo-microscopie électronique, l'électrophysiologie et les techniques de liaison de radioligands, nous avons élucidé l'assemblage de Nan-Iav et le mécanisme de sa liaison à des régulateurs de petites molécules. De plus, nous avons détecté la calmoduline (CaM) liée de manière constitutive à Iav et des pentamères de Nan stabilisés par AP. Ces résultats apportent des informations importantes sur la régulation des ions calcium dans les canaux, l'assemblage des canaux et les facteurs déterminant l'affinité de liaison des ligands. Plus important encore, nous avons confirmé que l'ARD joue un rôle central dans ces processus. Notre étude porte sur des canaux d'insectes complets liés à des pesticides agricoles pertinents.27, 28, 29ouvre des perspectives pour le développement de l'industrie des pesticides, en améliorant l'efficacité et la spécificité des pesticides et en permettant l'application de composés ciblant le TRPV à d'autres espèces afin de répondre aux enjeux de sécurité alimentaire mondiale et de lutte contre la propagation des maladies vectorielles.
Nous avons également constaté que Nan-Iav est régulé par le Ca2+ et que ce mécanisme de régulation est médié par la CaM liée de manière constitutive. Il est important de noter que cette régulation de Nav par la CaM, dépendante du Ca2+, diffère significativement des mécanismes de régulation d'autres canaux ioniques (par exemple, les canaux Na+ voltage-dépendants et les canaux TRPV5/6).52, 53, 54, 55, 56, 57Dans le canal Nav1.2, le domaine C-terminal de la CaM s'associe de manière hélicoïdale au domaine C-terminal (CTD), et le Ca2+ induit la liaison de son domaine N-terminal à la partie distale du CTD.56Dans le canal TRPV5/6, le domaine C-terminal de la CaM se lie à la CTH, et le Ca2+ induit une extension vers le haut de son domaine N-terminal dans le pore, bloquant ainsi la perméabilité aux cations.53,54Nous proposons un modèle pour la fonction régulée par le Ca²⁺ du complexe Nan-Iav-CaM (Fig. 4h). Dans ce modèle, le domaine N-terminal de la CaM se lie constitutivement au domaine C-terminal (CTH) de Iav. À l'état de repos (faible concentration de Ca²⁺), le domaine C-terminal de la CaM interagit avec Nan, stabilisant la conformation de l'ARD et favorisant ainsi l'ouverture du canal. La liaison d'un agoniste/insecticide au canal induit l'ouverture du pore, entraînant un influx de Ca²⁺. Le Ca²⁺ se lie alors à la CaM, provoquant la dissociation du domaine C-terminal de l'ARD de Nan. Le blocage de la liaison de la CaM abolissant quasiment l'effet inhibiteur du Ca²⁺, cette dissociation module la mobilité de l'ARD, induisant ainsi une inhibition ou une désensibilisation dépendante du Ca²⁺. La récupération rapide des courants du canal après l'élution des ions calcium (Fig. 4g) suggère que ce mécanisme facilite les réponses rapides aux signaux neuronaux médiés par le Ca²⁺. De plus, il a été rapporté que la région C-terminale de Iav, qui reste mal comprise, joue d'autres rôles dans le ciblage des canaux et la régulation du courant.21
Enfin, notre étude présente la structure à haute résolution d'un complexe de canaux TRP insecticide-insecticide d'importance agricole – une découverte jusqu'alors inconnue. Notamment, nous avons caractérisé la structure et la fonction de ce canal d'insecte dans des cellules humaines (HEK293S GnTi–) plutôt que dans des cellules d'insectes. Face à la résistance croissante aux insecticides et aux pressions constantes sur la sécurité alimentaire et les agents pathogènes, nos travaux apportent des informations importantes qui faciliteront le développement de nouveaux insecticides au bénéfice de la santé humaine et de la sécurité alimentaire mondiale. Des études ont montré que des insecticides tels que l'AP sont efficaces contre certains ravageurs lorsqu'ils sont utilisés conformément aux instructions d'utilisation et présentent une faible toxicité aiguë pour les pollinisateurs bénéfiques, ce qui démontre leur innocuité environnementale.13,16De plus, des tests menés sur des moustiques avec certains dérivés d'AP ont montré qu'ils finissent par perdre leur capacité à voler. Comprendre comment ces composés modulateurs se lient à Nan-Iav facilitera la modification de composés existants ou le développement de nouveaux composés pour une efficacité accrue.précisLutte antiparasitaire. Notre étude démontre que l'interface Nan-Iav ARD est essentielle non seulement à la régulation de l'activité des composés endogènes, des pesticides et du complexe Ca2+-CaM, mais aussi à l'assemblage du canal. Nous suggérons que la perturbation de l'assemblage des hétérodimères par de petites molécules pourrait constituer une approche originale et prometteuse pour le développement d'inhibiteurs de canaux ioniques.
Parmi les huit gènes orthologues, les gènes complets du coléoptère brun (Halyomorpha halys) Nanchung et Inactive ont été sélectionnés pour leur excellente stabilité aux détergents. Les gènes synthétisés ont été optimisés pour l'expression humaine et clonés dans le vecteur pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) en utilisant les sites de restriction XhoI et EcoRI. Ceci garantit que les clones sont en phase avec les étiquettes C-terminales GFP-FLAG-10xHis et mCherry-FLAG-10xHis, clivées par la protéase HRC-3C (PPX), permettant ainsi une expression indépendante.expressionLes amorces utilisées pour cloner Nanchung et Inactive dans le vecteur pBacMam étaient les suivantes :
Des images microscopiques de particules individuelles ont été obtenues à l'aide d'un microscope électronique à transmission Titan Krios G2 (FEI) équipé d'une caméra K3 et d'un filtre d'énergie Gatan BioQuantum. Le microscope a fonctionné à 300 keV, avec une énergie de 20 eV, une taille de pixel de 1,08 Å/pixel (grossissement nominal de 81 000x) et un gradient de défocalisation compris entre -0,8 et -2,2 μm. L'enregistrement vidéo a été réalisé à 40 images par seconde à l'aide d'un microscope Latitude S (Gatan), avec un débit de dose nominal de 25 e–px⁻¹ s⁻¹, un temps d'exposition de 2,4 s et une dose totale d'environ 60 e–Å⁻².
La correction des mouvements induits par le faisceau et la pondération de dose ont été réalisées sur film à l'aide de MotionCor2 dans RELION 4.061. L'estimation des paramètres de la fonction de transfert de contraste (FTC) a été effectuée dans cryoSPARC à l'aide de la méthode d'estimation de la FTC par patch62. Les photomicrographies présentant une résolution d'ajustement de la FTC ≥ 4 Å ont été exclues des analyses ultérieures. Généralement, un sous-ensemble de 500 à 1 000 photomicrographies a été utilisé pour la sélection des points dans cryoSPARC, suivi de plusieurs itérations de classification 2D après filtrage afin d'obtenir une image de référence claire pour la sélection des particules par gabarit. Les particules ont ensuite été extraites à l'aide de boîtes englobantes de 64 pixels et d'un regroupement par 4. Plusieurs itérations de classification 2D ont été réalisées pour éliminer les catégories de particules indésirables. Le modèle 3D initial a été reconstruit par reconstruction ab initio et affiné par raffinement non uniforme dans cryoSPARC. La classification 3D a été effectuée dans cryoSPARC ou RELION en fonction de l'hétérogénéité de l'ARD. Aucune hétérogénéité significative des domaines membranaires n'a été observée. Les particules ont été affinées par les méthodes C1 et C2 ; celles présentant une résolution C2 plus élevée ont été considérées comme symétriques par rapport à C2 et importées dans RELION pour un affinement bayésien. Elles ont ensuite été réimportées dans cryoSPARC pour un affinement final non uniforme et local. La résolution finale et le nombre de particules sont indiqués dans le tableau 1.
Lors du traitement des pentamères Nan+AP, nous avons exploré diverses méthodes pour améliorer la résolution des domaines membranaires (en particulier la région des pores), telles que la soustraction de signal et le masquage du TMD. Cependant, ces tentatives se sont avérées infructueuses en raison du désordre potentiellement extrême dans la région des pores et de l'hétérogénéité globale du TMD. La résolution finale a été calculée à l'aide d'un masque généré automatiquement par la méthode de traitement non uniforme de cryoSPARC, ciblant principalement la région ARD. Cette méthode a permis d'obtenir une résolution nettement supérieure à celle des domaines membranaires (en particulier la région VSLD).
Les modèles initiaux de novo des formes apo des bactéries Nanchung et Inactive ont d'abord été générés à l'aide de Coot63, puis ceux des bactéries Nan et Iav à l'aide d'AlphaFold264 afin d'identifier les régions de faible confiance. La modélisation de la calmoduline s'est basée sur des ajustements de corps rigides des modèles avec et sans Ca²⁺, respectivement disponibles dans les fichiers PDB 4JPZ56 et 1CFD65. Les modèles ont été affinés par raffinement sphérique pour garantir une stéréochimie correcte et une géométrie optimale. La phosphatidylcholine, la phosphatidyléthanolamine et la phosphatidylsérine ont ensuite été modélisées comme des densités lipidiques bien définies, et les ligands NAM et AP ont été placés dans les densités correspondantes au niveau des jonctions serrées. Les fichiers de contraintes ont été générés à partir de la chaîne SMILES des isoformes à l'aide d'eLBOW dans PHENIX66. Enfin, les modèles ont été affinés dans l'espace réel avec PHENIX, en utilisant une recherche locale sur grille et une minimisation globale avec contraintes de structure secondaire. Le serveur MolProbity a été utilisé pour l'affinement des modèles et l'analyse structurale, et les illustrations ont été réalisées avec PyMOL et UCSF Chimera X.67,68,69 L'analyse d'ouverture a été effectuée avec le serveur HOLE70 et la cartographie de la conservation des séquences avec le serveur Consurf71.
Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide des logiciels Igor Pro 6.2, Excel Office 365 et GraphPad Prism 7.0. Toutes les données quantitatives sont présentées sous forme de moyenne ± erreur standard (SEM). Le test t de Student (bilatéral, non apparié) a été utilisé pour comparer deux groupes. L'analyse de variance à un facteur (ANOVA), suivie du test post-hoc de Dunnett, a été utilisée pour comparer plusieurs groupes. *P< 0,05, **P< 0,01 et ***PLes valeurs de p < 0,001 ont été considérées comme statistiquement significatives en fonction de la distribution des données. Les valeurs de Kd et Ki, ainsi que leurs intervalles de confiance asymétriques à 95 %, ont été calculés à l'aide du logiciel GraphPad Prism 10.
Pour plus de détails sur la méthodologie de l'étude, veuillez consulter le résumé du rapport Nature Portfolio dont le lien figure dans cet article.
Le modèle initial a été construit à partir des modèles de calmoduline des bases de données PDB 4JPZ et 1CFD. Les coordonnées ont été déposées dans la Protein Data Bank (PDB) sous les numéros d'accès suivants : 9NVN (Nan-Iav-CaM sans ligand), 9NVO (Nan-Iav-CaM lié à la nicotinamide), 9NVP (Nan-Iav-CaM lié à la nicotinamide et à l'EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM lié à l'aphénidolpyrroline et au calcium), 9NVR (Nan-Iav-CaM lié à l'aphénidolpyrroline et à l'EDTA) et 9NVS (pentamère de Nan lié à l'aphénidolpyrroline). Les images de cryo-microscopie électronique correspondantes sont déposées dans la base de données de microscopie électronique (EMDB) sous les numéros d'accès suivants : EMD-49844 (Nan-Iav-CaM sans ligand), EMD-49845 (complexe Nan-Iav-CaM avec la nicotinamide), EMD-49846 (complexe Nan-Iav-CaM avec la nicotinamide et l'EDTA), EMD-49847 (complexe Nan-Iav-CaM avec l'aphidopyrroline et le calcium), EMD-49848 (complexe Nan-Iav-CaM avec l'aphidopyrroline et l'EDTA) et EMD-49849 (complexe pentamère de Nan avec l'aphidopyrroline). Les données brutes de l'analyse fonctionnelle sont présentées dans cet article.
Date de publication : 28 janvier 2026