Le médicament anthelminthique N,N-diéthyl-m-toluamide (DEET) inhibe l'AChE (acétylcholinestérase) et possède des propriétés cancérigènes potentielles en raison d'une vascularisation excessive. Dans cet article, nous montrons que le DEET stimule spécifiquement les cellules endothéliales qui favorisent l'angiogenèse, augmentant ainsi la croissance tumorale. Le DEET active les processus cellulaires conduisant à l'angiogenèse, notamment la prolifération, la migration et l'adhésion. Ceci est associé à une augmentation de la production de NO et de l'expression du VEGF dans les cellules endothéliales. L'inactivation de M3 ou l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques de M3 a aboli tous ces effets, suggérant que l'angiogenèse induite par le DEET est sensible à M3. Des expériences impliquant la signalisation calcique dans les cellules endothéliales et HEK surexprimant les récepteurs M3, ainsi que des études de liaison et d'amarrage, indiquent que le DEET agit comme un modulateur allostérique des récepteurs M3. De plus, le DEET inhibe l'AChE, augmentant ainsi la biodisponibilité de l'acétylcholine et sa liaison aux récepteurs M3, et renforçant les effets proangiogéniques par régulation allostérique.
Les CE primaires ont été isolées de l'aorte de souris suisses. La méthode d'extraction a été adaptée du protocole Kobayashi 26 . Les CE murines ont été cultivées dans du milieu EBM-2 supplémenté avec 5 % de FBS inactivé par la chaleur jusqu'au quatrième passage.
L'effet de deux concentrations de DEET sur la prolifération des cellules HUVEC, U87MG ou BF16F10 a été analysé à l'aide du kit CyQUANT Cell Proliferation Assay (Molecular Probes, C7026). En bref, 5.103 cellules par puits ont été ensemencées dans une plaque de 96 puits, laissées se fixer pendant une nuit, puis traitées au DEET pendant 24 h. Après avoir retiré le milieu de croissance, une solution de liaison de colorant a été ajoutée à chaque puits de la microplaque et les cellules ont été incubées à 37 °C pendant 30 min. Les niveaux de fluorescence ont été déterminés à l'aide d'un lecteur de microplaques multimode Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Allemagne) équipé de filtres d'excitation à 485 nm et de filtres d'émission à 530 nm.
Les cellules HUVEC ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à une densité de 104 cellules par puits. Les cellules ont été traitées au DEET pendant 24 h. La viabilité cellulaire a été évaluée à l'aide d'un test colorimétrique MTT (Sigma-Aldrich, M5655). Les valeurs de densité optique ont été obtenues sur un lecteur de microplaques multimode (Mithras LB940) à une longueur d'onde de 570 nm.
Les effets du DEET ont été étudiés à l'aide de tests d'angiogenèse in vitro. Un traitement par 10-8 M ou 10-5 M de DEET a augmenté la formation de longueur capillaire dans les cellules HUVEC (Fig. 1a, b, barres blanches). Comparativement au groupe témoin, le traitement par des concentrations de DEET allant de 10-14 à 10-5 M a montré que la longueur capillaire atteignait un plateau à 10-8 M de DEET (Fig. S2 supplémentaire). Aucune différence significative n'a été constatée dans l'effet proangiogénique in vitro des cellules HUVEC traitées par DEET à des concentrations comprises entre 10-8 M et 10-5 M.
Afin de déterminer l'effet du DEET sur la néovascularisation, nous avons réalisé des études de néovascularisation in vivo. Après 14 jours, les souris ayant reçu une injection de cellules endothéliales précultivées avec 10-8 M ou 10-5 M de DEET ont montré une augmentation significative de leur taux d'hémoglobine (Fig. 1c, barres blanches).
Français De plus, la néovascularisation induite par le DEET a été étudiée chez des souris porteuses de xénogreffes U87MG qui ont reçu une injection quotidienne (ip) de DEET à une dose connue pour induire des concentrations plasmatiques de 10-5 M, ce qui est normal chez les humains exposés. chez 23. Des tumeurs détectables (c'est-à-dire des tumeurs > 100 mm3) ont été observées 14 jours après l'injection de cellules U87MG chez des souris. Au jour 28, la croissance tumorale était significativement améliorée chez les souris traitées au DEET par rapport aux souris témoins (Fig. 1d, carrés). De plus, la coloration CD31 des tumeurs a montré que le DEET augmentait significativement la surface capillaire mais pas la densité des microvaisseaux. (Fig. 1e–g).
Pour déterminer le rôle des récepteurs muscariniques dans la prolifération induite par le DETA, 10-8 M ou 10-5 M de DETA en présence de pFHHSiD (10-7 M, un antagoniste sélectif du récepteur M3) ont été utilisés. Traitement des HUVEC. pFHHSiD a complètement bloqué les propriétés prolifératives du DETA à toutes les concentrations (tableau 1).
Dans ces conditions, nous avons également examiné si le DEET augmentait la longueur des capillaires dans les cellules HUVEC. De même, le pFHHSiD a significativement prévenu la longueur des capillaires induite par le DEET (Fig. 1a, b, barres grises). De plus, des expériences similaires ont été réalisées avec l'ARNsi M3. Bien que l'ARNsi témoin n'ait pas été efficace pour favoriser la formation de capillaires, l'inhibition du récepteur muscarinique M3 a supprimé la capacité du DEET à augmenter la longueur des capillaires (Fig. 1a, b, barres noires).
De plus, la vascularisation induite par le DEET 10-8 M ou 10-5 M in vitro et la néovascularisation in vivo ont été complètement bloquées par le pFHHSiD (Fig. 1c, d, cercles). Ces résultats indiquent que le DEET favorise l'angiogenèse par une voie sensible aux antagonistes sélectifs des récepteurs M3 ou au siRNA M3.
L'AChE est la cible moléculaire du DEET. Des médicaments comme le donépézil, qui agissent comme inhibiteurs de l'AChE, peuvent stimuler l'angiogenèse des CE in vitro et dans des modèles d'ischémie des membres postérieurs chez la souris14. Nous avons testé l'effet de deux concentrations de DEET sur l'activité enzymatique de l'AChE dans les HUVEC. Des concentrations faibles (10-8 M) et élevées (10-5 M) de DEET ont diminué l'activité endothéliale de l'AChE par rapport aux conditions témoins (Fig. 2).
Français Les deux concentrations de DEET (10-8 M et 10-5 M) ont réduit l'activité de l'acétylcholinestérase sur les cellules HUVEC. BW284c51 (10-5 M) a été utilisé comme témoin pour les inhibiteurs de l'acétylcholinestérase. Les résultats sont exprimés en pourcentage d'activité AChE sur les cellules HUVEC traitées avec les deux concentrations de DEET par rapport aux cellules traitées avec le véhicule. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± SEM de six expériences indépendantes. *p < 0,05 par rapport au témoin (test de comparaison multiple de Kruskal-Wallis et Dunn).
Français L'oxyde nitrique (NO) est impliqué dans le processus angiogénique 33, par conséquent, la production de NO dans les HUVEC stimulées par le DEET a été étudiée. La production endothéliale de NO traitée par le DEET a augmenté par rapport aux cellules témoins, mais n'est devenue significative qu'à une dose de 10-8 M (Fig. 3c). Pour déterminer les changements moléculaires contrôlant la production de NO induite par le DEET, l'expression et l'activation de l'eNOS ont été analysées par Western blot. Bien que le traitement au DEET n'ait pas modifié l'expression de l'eNOS, il a significativement augmenté la phosphorylation de l'eNOS à son site d'activation (Ser-1177) tout en diminuant son site inhibiteur (Thr-495) par rapport aux cellules non traitées dans la phosphorylation de l'eNOS (Fig. 3d). De plus, le rapport de l'eNOS phosphorylée au site d'activation et au site inhibiteur a été calculé après normalisation de la quantité d'eNOS phosphorylée à la quantité totale d'enzyme. Ce rapport a été significativement augmenté dans les cellules HUVEC traitées avec chaque concentration de DEET par rapport aux cellules non traitées (Fig. 3d).
Enfin, l'expression du VEGF, l'un des principaux facteurs proangiogéniques, a été analysée par Western blot. Le DEET a augmenté significativement l'expression du VEGF, tandis que le pFHHSiD a complètement bloqué cette expression.
Les effets du DEET étant sensibles à la fois au blocage pharmacologique et à la régulation négative des récepteurs M3, nous avons testé l'hypothèse selon laquelle le DEET pourrait améliorer la signalisation calcique. Étonnamment, le DEET n'a pas augmenté le calcium cytoplasmique dans les cellules HUVEC (données non présentées) et HEK/M3 (Fig. 4a, b) pour les deux concentrations utilisées.
Date de publication : 30 décembre 2024