Le médicament anthelminthique N,N-diéthyl-m-toluamide (DEETIl a été rapporté que le DEET inhibe l'AChE (acétylcholinestérase) et présente des propriétés potentiellement cancérogènes dues à une vascularisation excessive. Dans cet article, nous montrons que le DEET stimule spécifiquement les cellules endothéliales, favorisant ainsi l'angiogenèse et, par conséquent, la croissance tumorale. Le DEET active les processus cellulaires conduisant à l'angiogenèse, notamment la prolifération, la migration et l'adhésion. Ceci est associé à une augmentation de la production de NO et de l'expression du VEGF dans les cellules endothéliales. L'inhibition de l'expression du récepteur M3 ou l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques de M3 abolissent tous ces effets, suggérant que l'angiogenèse induite par le DEET est sensible à M3. Des expériences impliquant la signalisation calcique dans des cellules endothéliales et des cellules HEK surexprimant les récepteurs M3, ainsi que des études de liaison et d'amarrage moléculaire, indiquent que le DEET agit comme un modulateur allostérique des récepteurs M3. De plus, le DEET inhibe l'AChE, augmentant ainsi la biodisponibilité de l'acétylcholine et sa liaison aux récepteurs M3, et renforçant les effets pro-angiogéniques par régulation allostérique.
Les cellules endothéliales primaires ont été isolées de l'aorte de souris Swiss. La méthode d'extraction a été adaptée du protocole de Kobayashi26. Les cellules endothéliales murines ont été cultivées dans un milieu EBM-2 supplémenté avec 5 % de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur jusqu'au quatrième passage.
L’effet de deux concentrations de DEET sur la prolifération des cellules HUVEC, U87MG et BF16F10 a été analysé à l’aide du kit CyQUANT Cell Proliferation Assay (Molecular Probes, C7026). Brièvement, 5 × 10³ cellules par puits ont été ensemencées dans une plaque 96 puits, laissées à adhérer pendant une nuit, puis traitées avec du DEET pendant 24 h. Après élimination du milieu de culture, une solution de liaison au colorant a été ajoutée dans chaque puits de la microplaque et les cellules ont été incubées à 37 °C pendant 30 min. Les niveaux de fluorescence ont été déterminés à l’aide d’un lecteur de microplaques multimode Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Allemagne) équipé de filtres d’excitation à 485 nm et de filtres d’émission à 530 nm.
Des cellules HUVEC ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à une densité de 10⁴ cellules par puits. Les cellules ont été traitées au DEET pendant 24 h. La viabilité cellulaire a été évaluée par un test colorimétrique MTT (Sigma-Aldrich, M5655). Les valeurs de densité optique ont été obtenues à l'aide d'un lecteur de microplaques multimode (Mithras LB940) à une longueur d'onde de 570 nm.
Les effets du DEET ont été étudiés par des tests d'angiogenèse in vitro. Un traitement avec du DEET à des concentrations de 10⁻⁸ M ou 10⁻⁵ M a augmenté la longueur des capillaires formés par les HUVEC (Fig. 1a, b, barres blanches). Comparé au groupe témoin, un traitement avec des concentrations de DEET allant de 10⁻¹⁴ à 10⁻⁵ M a montré que la longueur des capillaires atteignait un plateau à 10⁻⁸ M (Fig. S2 supplémentaire). Aucune différence significative n'a été observée concernant l'effet pro-angiogénique in vitro des HUVEC traitées avec du DEET aux concentrations de 10⁻⁸ M et 10⁻⁵ M.
Afin de déterminer l'effet du DEET sur la néovascularisation, nous avons réalisé des études de néovascularisation in vivo. Après 14 jours, les souris ayant reçu une injection de cellules endothéliales pré-cultivées avec du DEET à des concentrations de 10⁻⁸ M ou 10⁻⁵ M ont présenté une augmentation significative de leur taux d'hémoglobine (Fig. 1c, barres blanches).
De plus, la néovascularisation induite par le DEET a été étudiée chez des souris porteuses de xénogreffes U87MG, ayant reçu quotidiennement des injections intrapéritonéales de DEET à une dose connue pour induire des concentrations plasmatiques de 10⁻⁵ M, concentration normale chez l'homme exposé. Des tumeurs détectables (tumeurs > 100 mm³) ont été observées 14 jours après l'injection de cellules U87MG chez les souris. Au 28ᵉ jour, la croissance tumorale était significativement plus importante chez les souris traitées au DEET que chez les souris témoins (Fig. 1d, carrés). Par ailleurs, le marquage CD31 des tumeurs a montré que le DEET augmentait significativement la surface capillaire, mais pas la densité microvasculaire (Fig. 1e–g).
Afin de déterminer le rôle des récepteurs muscariniques dans la prolifération induite par le DETA, du DETA à des concentrations de 10⁻⁸ M ou 10⁻⁵ M a été utilisé en présence de pFHHSiD (10⁻⁷ M, un antagoniste sélectif du récepteur M3). Le traitement des HUVEC par le pFHHSiD a complètement inhibé les propriétés prolifératives du DETA à toutes les concentrations testées (Tableau 1).
Dans ces conditions, nous avons également examiné si le DEET augmentait la longueur des capillaires dans les cellules HUVEC. De même, le pFHHSiD a significativement inhibé l'allongement des capillaires induit par le DEET (Fig. 1a, b, barres grises). Par ailleurs, des expériences similaires ont été réalisées avec un siRNA ciblant le récepteur muscarinique M3. Bien que le siRNA contrôle n'ait pas favorisé la formation de capillaires, l'inhibition de ce récepteur a aboli la capacité du DEET à augmenter la longueur des capillaires (Fig. 1a, b, barres noires).
De plus, la vascularisation induite in vitro par le DEET (à des concentrations de 10⁻⁸ M ou 10⁻⁵ M) et la néovascularisation in vivo ont été totalement inhibées par le pFHHSiD (Fig. 1c, d, cercles). Ces résultats indiquent que le DEET favorise l'angiogenèse via une voie sensible aux antagonistes sélectifs du récepteur M3 ou à l'ARNsi M3.
L'AChE est la cible moléculaire du DEET. Des médicaments comme le donépézil, qui agissent comme inhibiteurs de l'AChE, peuvent stimuler l'angiogenèse endothéliale in vitro et dans des modèles d'ischémie du membre postérieur chez la souris14. Nous avons testé l'effet de deux concentrations de DEET sur l'activité enzymatique de l'AChE dans les HUVEC. Les concentrations faibles (10-8 M) et élevées (10-5 M) de DEET ont diminué l'activité de l'AChE endothéliale par rapport aux conditions témoins (Fig. 2).
Les deux concentrations de DEET (10⁻⁸ M et 10⁻⁵ M) ont réduit l'activité de l'acétylcholinestérase sur les cellules HUVEC. Le BW284c51 (10⁻⁵ M) a été utilisé comme contrôle pour les inhibiteurs de l'acétylcholinestérase. Les résultats sont exprimés en pourcentage d'activité de l'AChE sur les cellules HUVEC traitées avec les deux concentrations de DEET par rapport aux cellules traitées avec le véhicule. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM) de six expériences indépendantes. *p < 0,05 par rapport au contrôle (tests de Kruskal-Wallis et de comparaisons multiples de Dunn).
L'oxyde nitrique (NO) étant impliqué dans le processus angiogénique33, sa production dans les HUVEC stimulées par le DEET a été étudiée. La production de NO endothélial induite par le DEET était augmentée par rapport aux cellules témoins, mais cette augmentation n'était significative qu'à une concentration de 10-8 M (Fig. 3c). Afin de déterminer les modifications moléculaires contrôlant la production de NO induite par le DEET, l'expression et l'activation de l'eNOS ont été analysées par Western blot. Bien que le traitement au DEET n'ait pas modifié l'expression de l'eNOS, il a augmenté significativement sa phosphorylation au niveau de son site d'activation (Ser-1177) tout en diminuant celle de son site d'inhibition (Thr-495) par rapport aux cellules non traitées (Fig. 3d). De plus, le rapport entre l'eNOS phosphorylée au niveau du site d'activation et celui du site d'inhibition a été calculé après normalisation de la quantité d'eNOS phosphorylée par rapport à la quantité totale d'enzyme. Ce rapport était significativement augmenté dans les HUVEC traitées avec chaque concentration de DEET par rapport aux cellules non traitées (Fig. 3d).
Enfin, l'expression du VEGF, l'un des principaux facteurs pro-angiogéniques, a été analysée par Western blot. Le DEET a augmenté significativement l'expression du VEGF, tandis que le pFHHSiD a complètement bloqué cette expression.
Étant donné que les effets du DEET sont sensibles à la fois au blocage pharmacologique et à la régulation négative des récepteurs M3, nous avons testé l'hypothèse selon laquelle le DEET pourrait amplifier la signalisation calcique. De façon surprenante, le DEET n'a pas augmenté le calcium cytoplasmique dans les cellules HUVEC (données non présentées) ni dans les cellules HEK/M3 (Fig. 4a, b), et ce, aux deux concentrations utilisées.
Date de publication : 30 décembre 2024