Dans cette étude, les effets stimulants du traitement combiné derégulateurs de croissance des plantesL’effet du 2,4-D et de la kinétine, ainsi que des nanoparticules d’oxyde de fer (Fe₃O₄-NPs), sur la morphogenèse in vitro et la production de métabolites secondaires chez *Hypericum perforatum* L. a été étudié. Le traitement optimisé [2,4-D (0,5 mg/L) + kinétine (2 mg/L) + Fe₃O₄-NPs (4 mg/L)] a significativement amélioré les paramètres de croissance des plantes : la hauteur a augmenté de 59,6 %, la longueur des racines de 114,0 %, le nombre de bourgeons de 180,0 % et la masse fraîche du cal de 198,3 % par rapport au groupe témoin. Ce traitement combiné a également amélioré l’efficacité de régénération (50,85 %) et augmenté la teneur en hypéricine de 66,6 %. L'analyse GC-MS a révélé des teneurs élevées en hypéroside, β-patholène et alcool cétylique, représentant 93,36 % de la surface totale des pics, tandis que les teneurs en composés phénoliques totaux et en flavonoïdes ont augmenté de 80,1 %. Ces résultats indiquent que les régulateurs de croissance des plantes (RCP) et les nanoparticules de Fe₃O₄ (Fe₃O₄-NP) exercent un effet synergique en stimulant l'organogenèse et l'accumulation de composés bioactifs, ce qui constitue une stratégie prometteuse pour l'amélioration biotechnologique des plantes médicinales.
Le millepertuis (Hypericum perforatum L.), également appelé herbe de la Saint-Jean, est une plante herbacée vivace de la famille des Hypericacées qui présente un intérêt économique.[1] Ses composants bioactifs potentiels comprennent des tanins naturels, des xanthones, du phloroglucinol, du naphtalènedianthrone (hypérine et pseudohypérine), des flavonoïdes, des acides phénoliques et des huiles essentielles.[2,3,4] Le millepertuis peut être propagé par des méthodes traditionnelles ; cependant, la saisonnalité de ces méthodes, le faible taux de germination des graines et la sensibilité aux maladies limitent son potentiel pour une culture à grande échelle et la production continue de métabolites secondaires.[1,5,6]
Ainsi, la culture de tissus in vitro est considérée comme une méthode efficace pour la multiplication rapide des plantes, la conservation des ressources génétiques et l'augmentation du rendement en composés médicinaux [7, 8]. Les régulateurs de croissance végétale (RCV) jouent un rôle crucial dans la régulation de la morphogenèse et sont nécessaires à la culture in vitro de cals et d'organismes entiers. L'optimisation de leurs concentrations et combinaisons est essentielle au bon déroulement de ces processus de développement [9]. Par conséquent, la compréhension de la composition et de la concentration appropriées des régulateurs est importante pour améliorer la croissance et la capacité de régénération du millepertuis (Hypericum perforatum) [10].
Les nanoparticules d'oxyde de fer (Fe₃O₄) constituent une classe de nanoparticules développées ou en cours de développement pour la culture tissulaire. Grâce à leurs propriétés magnétiques importantes, leur bonne biocompatibilité et leur capacité à favoriser la croissance des plantes et à réduire le stress environnemental, les nanoparticules Fe₃O₄ suscitent un intérêt considérable dans la conception de techniques de culture tissulaire. Parmi leurs applications potentielles, on peut citer l'optimisation de la culture in vitro pour stimuler la division cellulaire, améliorer l'absorption des nutriments et activer les enzymes antioxydantes [11].
Bien que les nanoparticules aient démontré des effets bénéfiques sur la croissance des plantes, les études sur l'application combinée de nanoparticules de Fe₃O₄ et de régulateurs de croissance optimisés chez *H. perforatum* restent rares. Afin de combler cette lacune, cette étude a évalué les effets combinés de ces substances sur la morphogenèse in vitro et la production de métabolites secondaires, dans le but d'améliorer les caractéristiques de cette plante médicinale. Cette étude poursuit donc deux objectifs : (1) optimiser la concentration des régulateurs de croissance pour favoriser efficacement la formation de cals, la régénération des pousses et l'enracinement in vitro ; et (2) évaluer les effets des nanoparticules de Fe₃O₄ sur les paramètres de croissance in vitro. Les travaux futurs prévoient d'évaluer le taux de survie des plantes régénérées lors de leur acclimatation in vitro. Les résultats de cette étude devraient améliorer significativement l'efficacité de la micropropagation de *H. perforatum*, contribuant ainsi à l'utilisation durable et aux applications biotechnologiques de cette importante plante médicinale.
Dans cette étude, nous avons prélevé des explants foliaires sur des plants de millepertuis annuels cultivés en plein champ (plants mères). Ces explants ont servi à optimiser les conditions de culture in vitro. Avant la mise en culture, les feuilles ont été soigneusement rincées à l'eau distillée courante pendant plusieurs minutes. La surface des explants a ensuite été désinfectée par immersion dans de l'éthanol à 70 % pendant 30 secondes, puis dans une solution d'hypochlorite de sodium (NaOCl) à 1,5 % contenant quelques gouttes de Tween 20 pendant 10 minutes. Enfin, les explants ont été rincés trois fois à l'eau distillée stérile avant d'être transférés dans le milieu de culture suivant.
Au cours des quatre semaines suivantes, les paramètres de régénération des pousses ont été mesurés, notamment le taux de régénération, le nombre de pousses par explant et leur longueur. Lorsque les pousses régénérées atteignaient une longueur d'au moins 2 cm, elles étaient transférées dans un milieu d'enracinement composé de milieu MS à demi-concentration, de 0,5 mg/L d'acide indolebutyrique (AIB) et de 0,3 % de gomme de guar. La culture d'enracinement se poursuivait pendant trois semaines, période durant laquelle le taux d'enracinement, le nombre de racines et leur longueur étaient mesurés. Chaque traitement était répété trois fois, avec 10 explants cultivés par répétition, soit environ 30 explants par traitement.
La hauteur des plantes a été mesurée en centimètres (cm) à l'aide d'une règle, de la base à l'extrémité de la feuille la plus haute. La longueur des racines a été mesurée en millimètres (mm) immédiatement après avoir délicatement prélevé les plantules et retiré le substrat de culture. Le nombre de bourgeons par explant a été compté directement sur chaque plante. Le nombre de taches noires sur les feuilles, appelées nodules, a été déterminé visuellement. Ces nodules noirs sont supposés être des glandes contenant de l'hypéricine, ou taches oxydatives, et servent d'indicateur physiologique de la réponse de la plante au traitement. Après avoir retiré tout le substrat de culture, le poids frais des plantules a été mesuré à l'aide d'une balance électronique d'une précision de milligrammes (mg).
La méthode de calcul du taux de formation de cals est la suivante : après avoir cultivé des explants dans un milieu contenant divers régulateurs de croissance (kinases, 2,4-D et Fe3O4) pendant quatre semaines, on compte le nombre d’explants capables de former des cals. La formule de calcul du taux de formation de cals est la suivante :
Chaque traitement a été répété trois fois, avec au moins 10 explants examinés à chaque répétition.
Le taux de régénération reflète la proportion de tissu calique qui achève avec succès le processus de différenciation des bourgeons après la formation du cal. Cet indicateur démontre la capacité du tissu calique à se transformer en tissu différencié et à donner naissance à de nouveaux organes végétaux.
Le coefficient d'enracinement est le rapport entre le nombre de branches capables de s'enraciner et le nombre total de branches. Cet indicateur reflète la réussite de l'enracinement, étape cruciale en micropropagation et en multiplication végétale, car un bon enracinement favorise la survie des jeunes plants en conditions de culture.
Les composés d'hypéricine ont été extraits avec du méthanol à 90 %. Cinquante mg de matière végétale séchée ont été ajoutés à 1 ml de méthanol et soumis à une sonication pendant 20 min à 30 kHz dans un appareil à ultrasons (modèle A5120-3YJ) à température ambiante et à l'abri de la lumière. Après sonication, l'échantillon a été centrifugé à 6 000 tr/min pendant 15 min. Le surnageant a été recueilli et l'absorbance de l'hypéricine a été mesurée à 592 nm à l'aide d'un spectrophotomètre Plus-3000 S, selon la méthode décrite par Conceiçao et al. [14].
La plupart des traitements à base de régulateurs de croissance végétale (RCV) et de nanoparticules d'oxyde de fer (Fe₃O₄-NPs) n'ont pas induit la formation de nodules noirs sur les feuilles des pousses régénérées. Aucun nodule n'a été observé dans les traitements contenant 0,5 ou 1 mg/L de 2,4-D, 0,5 ou 1 mg/L de kinétine, ou 1, 2 ou 4 mg/L de nanoparticules d'oxyde de fer. Quelques combinaisons ont montré une légère augmentation du développement des nodules (non significative statistiquement) à des concentrations plus élevées de kinétine et/ou de nanoparticules d'oxyde de fer, comme la combinaison de 2,4-D (0,5–2 mg/L) avec de la kinétine (1–1,5 mg/L) et des nanoparticules d'oxyde de fer (2–4 mg/L). Ces résultats sont présentés dans la figure 2. Les nodules noirs correspondent à des glandes riches en hypéricine, à la fois naturelles et bénéfiques. Dans cette étude, les nodules noirs étaient principalement associés au brunissement des tissus, indiquant un environnement favorable à l'accumulation d'hypéricine. Le traitement par le 2,4-D, la kinétine et les nanoparticules de Fe₃O₄ a favorisé la croissance du cal, réduit le brunissement et augmenté la teneur en chlorophylle, suggérant une amélioration de la fonction métabolique et une réduction potentielle des dommages oxydatifs [37]. Cette étude a évalué les effets de la kinétine en combinaison avec le 2,4-D et les nanoparticules de Fe₃O₄ sur la croissance et le développement du cal de millepertuis (Fig. 3a–g). Des études antérieures ont montré que les nanoparticules de Fe₃O₄ possèdent des activités antifongiques et antimicrobiennes [38, 39] et que, lorsqu'elles sont utilisées en combinaison avec des régulateurs de croissance végétale, elles peuvent stimuler les mécanismes de défense des plantes et réduire les indices de stress cellulaire [18]. Bien que la biosynthèse des métabolites secondaires soit génétiquement régulée, leur rendement réel dépend fortement des conditions environnementales. Les modifications métaboliques et morphologiques peuvent influencer les concentrations de métabolites secondaires en régulant l'expression de gènes spécifiques chez la plante et en répondant aux facteurs environnementaux. De plus, des inducteurs peuvent déclencher l'activation de nouveaux gènes, qui à leur tour stimulent l'activité enzymatique, activant ainsi de multiples voies de biosynthèse et conduisant à la formation de métabolites secondaires. Par ailleurs, une autre étude a montré que la réduction de l'ombrage augmente l'exposition à la lumière solaire, élevant ainsi les températures diurnes dans l'habitat naturel d'*Hypericum perforatum*, ce qui contribue également à une augmentation du rendement en hypéricine. À partir de ces données, cette étude a examiné le rôle des nanoparticules de fer comme inducteurs potentiels en culture tissulaire. Les résultats ont montré que ces nanoparticules peuvent activer les gènes impliqués dans la biosynthèse de l'hespéridine par stimulation enzymatique, entraînant une accumulation accrue de ce composé (Fig. 2). Par conséquent, comparativement aux plantes poussant dans des conditions naturelles, on peut supposer que la production de tels composés *in vivo* peut également être améliorée lorsqu'un stress modéré est combiné à l'activation de gènes impliqués dans la biosynthèse des métabolites secondaires. Les traitements combinés ont généralement un effet positif sur le taux de régénération, mais cet effet est parfois atténué. Notamment, un traitement avec 1 mg/L de 2,4-D, 1,5 mg/L de kinase et différentes concentrations de ces substances a permis d'augmenter significativement et indépendamment le taux de régénération de 50,85 % par rapport au groupe témoin (Fig. 4c). Ces résultats suggèrent que des combinaisons spécifiques de nanohormones peuvent agir en synergie pour favoriser la croissance des plantes et la production de métabolites, ce qui est d'une grande importance pour la culture de tissus de plantes médicinales. Palmer et Keller [50] ont montré qu'un traitement au 2,4-D pouvait induire à lui seul la formation de cals chez *St. perforatum*, tandis que l'ajout de kinase améliorait significativement la formation de cals et la régénération. Cet effet était dû à l'amélioration de l'équilibre hormonal et à la stimulation de la division cellulaire. Bal et al. [51] ont constaté qu'un traitement aux nanoparticules de Fe₃O₄ pouvait améliorer indépendamment la fonction des enzymes antioxydantes, favorisant ainsi la croissance racinaire chez *St. perforatum*. Des milieux de culture contenant des nanoparticules de Fe₃O₄ à des concentrations de 0,5 mg/L, 1 mg/L et 1,5 mg/L ont amélioré le taux de régénération des plants de lin [52]. L'utilisation de kinétine, de 2,4-dichlorobenzothiazolinone et de nanoparticules de Fe₃O₄ a significativement amélioré les taux de formation de cals et de racines. Cependant, les effets secondaires potentiels de l'utilisation de ces hormones pour la régénération in vitro doivent être pris en compte. Par exemple, une utilisation prolongée ou à forte concentration de 2,4-dichlorobenzothiazolinone ou de kinétine peut entraîner une variation clonale somatique, un stress oxydatif, une morphologie anormale des cals ou une vitrification. Par conséquent, un taux de régénération élevé ne prédit pas nécessairement la stabilité génétique. Toutes les plantes régénérées doivent être évaluées à l'aide de marqueurs moléculaires (par exemple RAPD, ISSR, AFLP) ou d'une analyse cytogénétique afin de déterminer leur homogénéité et leur similarité avec les plantes in vivo [53, 54, 55].
Cette étude a démontré pour la première fois que l'utilisation combinée de régulateurs de croissance végétale (2,4-D et kinétine) et de nanoparticules de Fe₃O₄ peut améliorer la morphogenèse et l'accumulation de métabolites bioactifs clés (dont l'hypéricine et l'hypéroside) chez *Hypericum perforatum*. Le traitement optimisé (1 mg/L de 2,4-D + 1 mg/L de kinétine + 4 mg/L de nanoparticules de Fe₃O₄) a non seulement maximisé la formation de cals, l'organogenèse et le rendement en métabolites secondaires, mais a également démontré un léger effet inducteur, améliorant potentiellement la tolérance au stress et la valeur médicinale de la plante. L'association de la nanotechnologie et de la culture de tissus végétaux offre une plateforme durable et efficace pour la production *in vitro* à grande échelle de composés médicinaux. Ces résultats ouvrent la voie à des applications industrielles et à de futures recherches sur les mécanismes moléculaires, l'optimisation des dosages et la précision génétique, reliant ainsi la recherche fondamentale sur les plantes médicinales à la biotechnologie appliquée.
Date de publication : 12 décembre 2025