La croissance du méristème apical des pousses (MAP) est essentielle à l'architecture de la tige. Hormones végétalesgibbérellinesLes GA jouent un rôle essentiel dans la coordination de la croissance des plantes, mais leur rôle dans le SAM reste mal compris. Nous avons développé un biocapteur ratiométrique de la signalisation des GA en modifiant la protéine DELLA pour supprimer sa fonction régulatrice essentielle dans la réponse transcriptionnelle des GA tout en préservant sa dégradation lors de la reconnaissance des GA. Nous démontrons que ce biocapteur basé sur la dégradation enregistre avec précision les variations des taux de GA et de la détection cellulaire au cours du développement. Nous l'avons utilisé pour cartographier l'activité de signalisation des GA dans le SAM. Nous montrons que des signaux GA élevés sont présents principalement dans les cellules situées entre les primordiums d'organes, précurseurs des cellules internodales. En utilisant des approches de gain et de perte de fonction, nous démontrons en outre que les GA régulent l'orientation du plan de division cellulaire, établissant l'organisation cellulaire canonique des entre-nœuds, favorisant ainsi la spécification des entre-nœuds dans le SAM.
Le méristème apical de la pousse (MAP), situé à l'apex de la pousse, contient une niche de cellules souches dont l'activité génère des organes latéraux et des nœuds de la tige de manière modulaire et itérative tout au long de la vie de la plante. Chacune de ces unités répétitives, ou nœuds végétaux, comprend des entre-nœuds et des organes latéraux aux nœuds, ainsi que des méristèmes axillaires à l'aisselle des feuilles1. La croissance et l'organisation des nœuds végétaux changent au cours du développement. Chez Arabidopsis, la croissance internodale est inhibée pendant la phase végétative, et les méristèmes axillaires restent dormants à l'aisselle des feuilles en rosette. Lors de la transition vers la phase florale, le MAP devient le méristème de l'inflorescence, générant des entre-nœuds allongés et des bourgeons axillaires, des rameaux à l'aisselle des feuilles caulinaires, puis des fleurs aphylles2. Bien que nous ayons réalisé des progrès significatifs dans la compréhension des mécanismes qui contrôlent l'initiation des feuilles, des fleurs et des branches, on en sait relativement peu sur la façon dont les entre-nœuds apparaissent.
La compréhension de la distribution spatiotemporelle des GA permettra de mieux comprendre les fonctions de ces hormones dans différents tissus et à différents stades de développement. La visualisation de la dégradation de la fusion RGA-GFP exprimée sous l'action de son propre promoteur fournit des informations importantes sur la régulation des taux totaux de GA dans les racines15,16. Cependant, l'expression de RGA varie selon les tissus17 et est régulée par GA18. Ainsi, l'expression différentielle du promoteur RGA peut être à l'origine du profil de fluorescence observé avec RGA-GFP et cette méthode n'est donc pas quantitative. Plus récemment, la GA marquée à la fluorescéine bioactive (Fl)19,20 a révélé l'accumulation de GA dans l'endocortex racinaire et la régulation de ses taux cellulaires par le transport de GA. Récemment, le capteur de FRET de GA nlsGPS1 a montré que les taux de GA sont corrélés à l'élongation cellulaire dans les racines, les filaments et les hypocotyles à croissance sombre21. Cependant, comme nous l'avons vu, la concentration de GA n'est pas le seul paramètre contrôlant l'activité de signalisation de GA, car elle dépend de processus de détection complexes. En nous appuyant sur notre compréhension des voies de signalisation DELLA et GA, nous rapportons ici le développement et la caractérisation d'un biocapteur ratiométrique basé sur la dégradation pour la signalisation de GA. Pour développer ce biocapteur quantitatif, nous avons utilisé un RGA mutant sensible à GA, fusionné à une protéine fluorescente et exprimé de manière ubiquitaire dans les tissus, ainsi qu'une protéine fluorescente insensible à GA. Nous démontrons que les fusions de protéines RGA mutantes n'interfèrent pas avec la signalisation endogène de GA lorsqu'elles sont exprimées de manière ubiquitaire, et que ce biocapteur peut quantifier l'activité de signalisation résultant à la fois de l'entrée de GA et du traitement du signal de GA par l'appareil de détection avec une haute résolution spatio-temporelle. Nous avons utilisé ce biocapteur pour cartographier la distribution spatio-temporelle de l'activité de signalisation de GA et quantifier la façon dont GA régule le comportement cellulaire dans l'épiderme SAM. Nous démontrons que GA régule l'orientation du plan de division des cellules SAM situées entre les primordiums d'organes, définissant ainsi l'organisation cellulaire canonique de l'entre-nœud.
Enfin, nous avons cherché à savoir si qmRGA pouvait signaler des changements dans les niveaux endogènes de GA en utilisant des hypocotyles en croissance. Nous avons précédemment montré que le nitrate stimule la croissance en augmentant la synthèse de GA et, par conséquent, la dégradation de DELLA34. Par conséquent, nous avons observé que la longueur de l'hypocotyle chez les plantules pUBQ10::qmRGA cultivées sous un apport abondant de nitrate (10 mM NO3−) était significativement plus longue que celle des plantules cultivées dans des conditions de carence en nitrate (Fig. 6a supplémentaire). Conformément à la réponse de croissance, les signaux de GA étaient plus élevés dans les hypocotyles des plantules cultivées sous 10 mM NO3− que dans les plantules cultivées en l'absence de nitrate (Fig. 6b, c supplémentaire). Ainsi, qmRGA permet également de surveiller les changements dans la signalisation de GA induits par des changements endogènes dans la concentration de GA.
Afin de comprendre si l'activité de signalisation de l'AG détectée par qmRGA dépend de la concentration et de la perception de l'AG, comme prévu d'après la conception du capteur, nous avons analysé l'expression des trois récepteurs GID1 dans les tissus végétatifs et reproducteurs. Chez les plantules, la lignée rapporteuse GID1-GUS a montré que GID1a et c étaient fortement exprimés dans les cotylédons (Fig. 3a–c). De plus, les trois récepteurs étaient exprimés dans les feuilles, les primordiums racinaires latéraux, les extrémités des racines (à l'exception de la coiffe racinaire de GID1b) et le système vasculaire (Fig. 3a–c). Dans le SAM de l'inflorescence, nous avons détecté des signaux GUS uniquement pour GID1b et 1c (Fig. 7a–c supplémentaire). L'hybridation in situ a confirmé ces profils d'expression et a démontré que GID1c était uniformément exprimé à de faibles niveaux dans le SAM, tandis que GID1b présentait une expression plus élevée à la périphérie du SAM (Fig. 7d–l supplémentaire). La fusion traductionnelle pGID1b::2xmTQ2-GID1b a également révélé une variation de l'expression de GID1b, allant d'une expression faible ou nulle au centre du SAM à une expression élevée aux limites des organes (Fig. 7m supplémentaire). Ainsi, les récepteurs GID1 ne sont pas répartis uniformément à travers et au sein des tissus. Lors d'expériences ultérieures, nous avons également observé que la surexpression de GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) augmentait la sensibilité de qmRGA dans les hypocotyles à l'application externe de GA (Fig. 3d, e). En revanche, la fluorescence mesurée par qd17mRGA dans l'hypocotyle était insensible au traitement par GA3 (Fig. 3f, g). Pour les deux tests, les plantules ont été traitées avec de fortes concentrations de GA (100 μM de GA3) afin d'évaluer le comportement rapide du capteur, où la capacité à se lier au récepteur GID1 était augmentée ou perdue. Ensemble, ces résultats confirment que le biocapteur qmRGA remplit une fonction combinée en tant que capteur GA et GA, et suggèrent que l'expression différentielle du récepteur GID1 peut moduler de manière significative l'émissivité du capteur.
Français À ce jour, la distribution des signaux GA dans le SAM reste floue. Par conséquent, nous avons utilisé des plantes exprimant qmRGA et le rapporteur de cellules souches pCLV3::mCherry-NLS35 pour calculer des cartes quantitatives à haute résolution de l'activité de signalisation GA, en nous concentrant sur la couche L1 (épiderme ; Fig. 4a, b, voir Méthodes et méthodes supplémentaires), car L1 joue un rôle clé dans le contrôle de la croissance du SAM36. Ici, l'expression de pCLV3::mCherry-NLS a fourni un point de référence géométrique fixe pour analyser la distribution spatiotemporelle de l'activité de signalisation GA37. Bien que GA soit considéré comme essentiel au développement des organes latéraux4, nous avons observé que les signaux GA étaient faibles dans le primordium floral (P) à partir du stade P3 (Fig. 4a, b), tandis que les jeunes primordiums P1 et P2 avaient une activité modérée similaire à celle de la région centrale (Fig. 4a, b). Français Une activité de signalisation GA plus élevée a été détectée aux limites des primordiums d'organes, commençant à P1/P2 (sur les côtés de la limite) et culminant à P4, ainsi que dans toutes les cellules de la région périphérique située entre les primordiums (Fig. 4a, b et Fig. supplémentaire 8a, b). Cette activité de signalisation GA plus élevée a été observée non seulement dans l'épiderme, mais aussi dans les couches L2 et L3 supérieure (Fig. supplémentaire 8b). Le profil des signaux GA détectés dans le SAM à l'aide de qmRGA est également resté inchangé au fil du temps (Fig. supplémentaire 8c–f, k). Bien que la construction qd17mRGA ait été systématiquement régulée à la baisse dans le SAM des plantes T3 de cinq lignées indépendantes que nous avons caractérisées en détail, nous avons pu analyser les profils de fluorescence obtenus avec la construction pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Fig. supplémentaire 8g–j, l). Dans cette lignée témoin, seuls des changements mineurs du rapport de fluorescence ont été détectés dans le SAM, mais au centre du SAM, nous avons observé une diminution nette et inattendue de VENUS associée à TagBFP. Cela confirme que le schéma de signalisation observé par qmRGA reflète la dégradation dépendante de GA de mRGA-VENUS, mais démontre également que qmRGA peut surestimer l'activité de signalisation GA dans le centre du méristème. En résumé, nos résultats révèlent un schéma de signalisation GA qui reflète principalement la distribution des primordiums. Cette distribution de la région inter-primordiale (IPR) est due à l'établissement progressif d'une activité de signalisation GA élevée entre le primordium en développement et la région centrale, tandis que dans le même temps, l'activité de signalisation GA dans le primordium diminue (Fig. 4c, d).
Français La distribution des récepteurs GID1b et GID1c (voir ci-dessus) suggère que l'expression différentielle des récepteurs GA contribue à façonner le profil de l'activité de signalisation GA dans le SAM. Nous nous sommes demandé si une accumulation différentielle de GA pourrait être impliquée. Pour étudier cette possibilité, nous avons utilisé le capteur FRET GA nlsGPS121. Une fréquence d'activation accrue a été détectée dans le SAM de nlsGPS1 traité avec 10 μM de GA4+7 pendant 100 min (Fig. supplémentaire 9a–e), indiquant que nlsGPS1 réagit aux changements de concentration de GA dans le SAM, comme il le fait dans les racines21. La distribution spatiale de la fréquence d'activation de nlsGPS1 a révélé des niveaux de GA relativement faibles dans les couches externes du SAM, mais a montré qu'ils étaient élevés au centre et aux bords du SAM (Fig. 4e et Fig. supplémentaire 9a,c). Français Cela suggère que GA est également distribué dans le SAM avec un motif spatial comparable à celui révélé par qmRGA. Comme approche complémentaire, nous avons également traité le SAM avec GA fluorescent (GA3-, GA4-, GA7-Fl) ou Fl seul comme contrôle négatif. Le signal Fl était distribué dans tout le SAM, y compris la région centrale et le primordium, bien qu'à une intensité plus faible (Fig. 4j et Fig. Supplémentaire 10d). En revanche, les trois GA-Fl se sont accumulés spécifiquement dans les bordures du primordium et à des degrés divers dans le reste de l'IPR, GA7-Fl s'accumulant dans le plus grand domaine de l'IPR (Fig. 4k et Fig. Supplémentaire 10a,b). La quantification de l'intensité de fluorescence a révélé que le rapport intensité IPR/non-IPR était plus élevé dans le SAM traité par GA-Fl que dans le SAM traité par Fl (Fig. 4l et Fig. Supplémentaire 10c). Ensemble, ces résultats suggèrent que l'AG est présente à des concentrations plus élevées dans les cellules IPR situées au plus près des limites organiques. Ceci suggère que le profil d'activité de signalisation de l'AG dans le SAM résulte à la fois d'une expression différentielle des récepteurs de l'AG et d'une accumulation différentielle de l'AG dans les cellules IPR proches des limites organiques. Ainsi, notre analyse a révélé un profil spatiotemporel inattendu de signalisation de l'AG, avec une activité plus faible au centre et au primordium du SAM et une activité plus élevée dans l'IPR en périphérie.
Pour comprendre le rôle de l'activité différentielle de signalisation GA dans le SAM, nous avons analysé la corrélation entre l'activité de signalisation GA, l'expansion cellulaire et la division cellulaire en utilisant l'imagerie accélérée en temps réel du SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Étant donné le rôle de GA dans la régulation de la croissance, une corrélation positive avec les paramètres d'expansion cellulaire était attendue. Par conséquent, nous avons d'abord comparé les cartes d'activité de signalisation GA avec les cartes du taux de croissance de la surface cellulaire (comme indicateur de la force de l'expansion cellulaire pour une cellule donnée et pour les cellules filles à la division) et avec les cartes d'anisotropie de croissance, qui mesure la directionnalité de l'expansion cellulaire (également utilisée ici pour une cellule donnée et pour les cellules filles à la division ; Fig. 5a,b, voir Méthodes et Méthodes supplémentaires). Nos cartes du taux de croissance de la surface cellulaire du SAM sont cohérentes avec les observations précédentes38,39, avec des taux de croissance minimaux à la bordure et des taux de croissance maximaux dans les fleurs en développement (Fig. 5a). Français L'analyse en composantes principales (ACP) a montré que l'activité de signalisation GA était négativement corrélée à l'intensité de la croissance de la surface cellulaire (Figure 5c). Nous avons également montré que les principaux axes de variation, y compris l'entrée de signalisation GA et l'intensité de la croissance, étaient orthogonaux à la direction déterminée par une expression élevée de CLV3, confirmant l'exclusion des cellules du centre SAM dans les analyses restantes. L'analyse de corrélation de Spearman a confirmé les résultats de l'ACP (Figure 5d), indiquant que des signaux GA plus élevés dans l'IPR n'entraînaient pas une expansion cellulaire plus importante. Cependant, l'analyse de corrélation a révélé une légère corrélation positive entre l'activité de signalisation GA et l'anisotropie de la croissance (Figure 5c, d), suggérant qu'une signalisation GA plus élevée dans l'IPR influence la direction de la croissance cellulaire et peut-être la position du plan de division cellulaire.
a, b Cartes thermiques de la croissance de surface moyenne (a) et de l'anisotropie de croissance (b) dans SAM, moyennées sur sept plantes indépendantes (utilisées comme indicateurs de la force et de la direction de l'expansion cellulaire, respectivement). c L'analyse PCA incluait les variables suivantes : signal GA, intensité de la croissance de surface, anisotropie de la croissance de surface et expression de CLV3. Le composant 1 de l'ACP était principalement corrélé négativement à l'intensité de la croissance de surface et positivement corrélé au signal GA. Le composant 2 de l'ACP était principalement corrélé positivement à l'anisotropie de la croissance de surface et négativement corrélé à l'expression de CLV3. Les pourcentages représentent la variation expliquée par chaque composant. d Analyse de corrélation de Spearman entre le signal GA, l'intensité de la croissance de surface et l'anisotropie de la croissance de surface à l'échelle du tissu, à l'exclusion de CZ. Le nombre à droite est la valeur rho de Spearman entre deux variables. Les astérisques indiquent les cas où la corrélation/corrélation négative est hautement significative. e Visualisation 3D des cellules Col-0 SAM L1 par microscopie confocale. Français Les nouvelles parois cellulaires formées dans le SAM (mais pas le primordium) à 10 h sont colorées en fonction de leurs valeurs d'angle. La barre de couleur est affichée dans le coin inférieur droit. L'encart montre l'image 3D correspondante à 0 h. L'expérience a été répétée deux fois avec des résultats similaires. f Les boîtes à moustaches affichent les taux de division cellulaire dans les SAM Col-0 IPR et non-IPR (n = 10 plantes indépendantes). La ligne centrale indique la médiane et les limites des boîtes indiquent les 25e et 75e percentiles. Les moustaches indiquent les valeurs minimales et maximales déterminées avec le logiciel R. Les valeurs de p ont été obtenues avec le test t bilatéral de Welch. g, h Diagramme schématique montrant (g) comment mesurer l'angle de la nouvelle paroi cellulaire (magenta) par rapport à la direction radiale à partir du centre du SAM (ligne pointillée blanche) (seules les valeurs d'angle aigu, c'est-à-dire 0-90°, sont prises en compte), et (h) les directions circonférentielle/latérale et radiale à l'intérieur du méristème. i Histogrammes de fréquence de l'orientation du plan de division cellulaire à travers le SAM (bleu foncé), l'IPR (bleu moyen) et le non-IPR (bleu clair), respectivement. Les valeurs de p ont été obtenues par un test bilatéral de Kolmogorov-Smirnov. L'expérience a été répétée deux fois avec des résultats similaires. j Histogrammes de fréquence de l'orientation du plan de division cellulaire de l'IPR autour de P3 (vert clair), P4 (vert moyen) et P5 (vert foncé), respectivement. Les valeurs de p ont été obtenues par un test bilatéral de Kolmogorov-Smirnov. L'expérience a été répétée deux fois avec des résultats similaires.
Nous avons ensuite étudié la corrélation entre la signalisation GA et l'activité de division cellulaire en identifiant les parois cellulaires nouvellement formées au cours de l'essai (Fig. 5e). Cette approche nous a permis de mesurer la fréquence et la direction de la division cellulaire. Étonnamment, nous avons constaté que la fréquence des divisions cellulaires dans l'IPR et le reste du SAM (non-IPR, Fig. 5f) était similaire, indiquant que les différences de signalisation GA entre les cellules IPR et non-IPR n'affectent pas significativement la division cellulaire. Ceci, ainsi que la corrélation positive entre la signalisation GA et l'anisotropie de croissance, nous a incités à nous demander si l'activité de signalisation GA pouvait influencer l'orientation du plan de division cellulaire. Français Nous avons mesuré l'orientation de la nouvelle paroi cellulaire comme un angle aigu par rapport à l'axe radial reliant le centre du méristème et le centre de la nouvelle paroi cellulaire (Fig. 5e-i) et observé une nette tendance des cellules à se diviser à des angles proches de 90° par rapport à l'axe radial, les fréquences les plus élevées étant observées à 70–80° (23,28 %) et 80–90° (22,62 %) (Fig. 5e,i), correspondant à des divisions cellulaires dans le sens circonférentiel/transversal (Fig. 5h). Pour examiner la contribution de la signalisation GA à ce comportement de division cellulaire, nous avons analysé séparément les paramètres de division cellulaire dans l'IPR et non-IPR (Fig. 5i). Français Nous avons observé que la distribution des angles de division dans les cellules IPR différait de celle des cellules non IPR ou des cellules de l'ensemble du SAM, les cellules IPR présentant une proportion plus élevée de divisions cellulaires latérales/circulaires, c'est-à-dire 70-80° et 80-90° (33,86 % et 30,71 %, respectivement, proportions correspondantes) (Fig. 5i). Ainsi, nos observations ont révélé une association entre une signalisation GA élevée et une orientation du plan de division cellulaire proche de la direction circonférentielle, similaire à la corrélation entre l'activité de signalisation GA et l'anisotropie de croissance (Fig. 5c, d). Pour établir davantage la conservation spatiale de cette association, nous avons mesuré l'orientation du plan de division dans les cellules IPR entourant le primordium à partir de P3, puisque l'activité de signalisation GA la plus élevée a été détectée dans cette région à partir de P4 (Fig. 4). Français Les angles de division de l'IPR autour de P3 et P4 n'ont montré aucune différence statistiquement significative, bien qu'une fréquence accrue de divisions cellulaires latérales ait été observée dans l'IPR autour de P4 (Fig. 5j). Cependant, dans les cellules de l'IPR autour de P5, la différence d'orientation du plan de division cellulaire est devenue statistiquement significative, avec une forte augmentation de la fréquence des divisions cellulaires transversales (Fig. 5j). Ensemble, ces résultats suggèrent que la signalisation GA peut contrôler l'orientation des divisions cellulaires dans le SAM, ce qui est cohérent avec les rapports précédents40,41 selon lesquels une signalisation GA élevée peut induire une orientation latérale des divisions cellulaires dans l'IPR.
Il est prédit que les cellules de l'IPR ne seront pas incorporées dans les primordiums, mais plutôt dans les entre-nœuds2,42,43. L'orientation transversale des divisions cellulaires dans l'IPR pourrait entraîner l'organisation typique de rangées longitudinales parallèles de cellules épidermiques dans les entre-nœuds. Nos observations décrites ci-dessus suggèrent que la signalisation GA joue probablement un rôle dans ce processus en régulant la direction de la division cellulaire.
Français La perte de fonction de plusieurs gènes DELLA entraîne une réponse GA constitutive, et les mutants della peuvent être utilisés pour tester cette hypothèse44. Nous avons d'abord analysé les profils d'expression de cinq gènes DELLA dans le SAM. La fusion transcriptionnelle de la lignée GUS45 a révélé que GAI, RGA, RGL1 et RGL2 (dans une bien moindre mesure) étaient exprimés dans le SAM (Fig. 11a-d supplémentaire). L'hybridation in situ a en outre démontré que l'ARNm de GAI s'accumule spécifiquement dans les primordiums et les fleurs en développement (Fig. 11e supplémentaire). L'ARNm de RGL1 et RGL3 a été détecté dans toute la canopée du SAM et dans les fleurs plus âgées, tandis que l'ARNm de RGL2 était plus abondant dans la région de bordure (Fig. 11f-h supplémentaire). L'imagerie confocale du SAM pRGL3::RGL3-GFP a confirmé l'expression observée par hybridation in situ et a montré que la protéine RGL3 s'accumule dans la partie centrale du SAM (Fig. 11i supplémentaire). En utilisant la lignée pRGA::GFP-RGA, nous avons également constaté que la protéine RGA s'accumule dans le SAM, mais que son abondance diminue à la frontière à partir de P4 (Fig. 11j supplémentaire). Notamment, les profils d'expression de RGL3 et de RGA sont cohérents avec une activité de signalisation GA plus élevée dans l'IPR, comme détecté par qmRGA (Fig. 4). De plus, ces données indiquent que tous les DELLA sont exprimés dans le SAM et que leur expression collective couvre l'ensemble du SAM.
Français Nous avons ensuite analysé les paramètres de division cellulaire dans le SAM de type sauvage (Ler, témoin) et les mutants gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) (Fig. 6a, b). Il est intéressant de noter que nous avons observé un décalage statistiquement significatif dans la distribution des fréquences d'angle de division cellulaire dans le SAM mutant della global par rapport au type sauvage (Fig. 6c). Ce changement dans le mutant della global était dû à une augmentation de la fréquence des angles de 80–90° (34,71 % contre 24,55 %) et, dans une moindre mesure, des angles de 70–80° (23,78 % contre 20,18 %), c'est-à-dire correspondant aux divisions cellulaires transversales (Fig. 6c). La fréquence des divisions non transversales (0–60°) était également plus faible dans le mutant della global (Fig. 6c). Français La fréquence des divisions cellulaires transversales était significativement augmentée dans le SAM du mutant della global (Fig. 6b). La fréquence des divisions cellulaires transversales dans l'IPR était également plus élevée chez le mutant della global par rapport au type sauvage (Fig. 6d). En dehors de la région IPR, le type sauvage avait une distribution plus uniforme des angles de division cellulaire, tandis que le mutant della global préférait les divisions tangentielles comme l'IPR (Fig. 6e). Nous avons également quantifié l'orientation des divisions cellulaires dans le SAM des mutants quintuples de la ga2 oxydase (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 et ga2ox6-2), un fond mutant inactif pour la GA dans lequel la GA s'accumule. Conformément à l'augmentation des niveaux de GA, le SAM de l'inflorescence mutante quintuple ga2ox était plus grand que celui de Col-0 (Fig. 12a, b supplémentaires), et comparé à Col-0, le SAM quintuple ga2ox présentait une distribution des angles de division cellulaire nettement différente, la fréquence des angles augmentant de 50° à 90°, favorisant ainsi à nouveau les divisions tangentielles (Fig. 12a–c supplémentaires). Ainsi, nous montrons que l'activation constitutive de la signalisation GA et l'accumulation de GA induisent des divisions cellulaires latérales dans l'IPR et le reste du SAM.
a, b Visualisation 3D de la couche L1 du SAM du mutant Ler (a) et du mutant della global (b) coloré au PI en microscopie confocale. Les nouvelles parois cellulaires formées dans le SAM (mais pas dans le primordium) sur une période de 10 h sont représentées et colorées en fonction de leurs valeurs d'angle. L'encart montre le SAM à 0 h. La barre de couleur est affichée dans le coin inférieur droit. La flèche en (b) pointe vers un exemple de fichiers cellulaires alignés dans le mutant della global. L'expérience a été répétée deux fois avec des résultats similaires. ce Comparaison de la distribution de fréquence des orientations du plan de division cellulaire dans le SAM entier (d), l'IPR (e) et le non-IPR (f) entre Ler et le della global. Les valeurs de p ont été obtenues à l'aide d'un test bilatéral de Kolmogorov-Smirnov. f, g Visualisation 3D d'images confocales du SAM coloré au PI des plantes transgéniques Col-0 (i) et pCUC2::gai-1-VENUS (j). Français Les panneaux (a, b) montrent de nouvelles parois cellulaires (mais pas de primordiums) formées dans le SAM en 10 h. L'expérience a été répétée deux fois avec des résultats similaires. h–j Comparaison de la distribution de fréquence des orientations du plan de division cellulaire situées dans l'ensemble du SAM (h), IPR (i) et non-IPR (j) entre les plantes Col-0 et pCUC2::gai-1-VENUS. Les valeurs de p ont été obtenues à l'aide d'un test de Kolmogorov-Smirnov bilatéral.
Nous avons ensuite testé l'effet de l'inhibition de la signalisation GA spécifiquement dans l'IPR. À cette fin, nous avons utilisé le promoteur CUC2 (Cotyledon Cup 2) pour stimuler l'expression d'une protéine gai-1 dominante négative fusionnée à VENUS (dans la lignée pCUC2::gai-1-VENUS). Dans la SAM sauvage, le promoteur CUC2 stimule l'expression de la plupart des IPR dans la SAM, y compris les cellules de bordure, à partir de P4, et une expression spécifique similaire a été observée chez les plantes pCUC2::gai-1-VENUS (voir ci-dessous). La distribution des angles de division cellulaire dans la SAM ou l'IPR des plantes pCUC2::gai-1-VENUS n'était pas significativement différente de celle du type sauvage, bien que, de manière inattendue, nous ayons constaté que les cellules sans IPR chez ces plantes se divisaient à une fréquence plus élevée de 80 à 90° (Fig. 6f–j).
Français Il a été suggéré que la direction de la division cellulaire dépend de la géométrie du SAM, en particulier de la contrainte de traction générée par la courbure du tissu46. Nous avons donc cherché à savoir si la forme du SAM était altérée dans les plantes mutantes della global et pCUC2::gai-1-VENUS. Comme indiqué précédemment12, la taille du SAM du mutant della global était plus grande que celle du type sauvage (Fig. 13a, b, d supplémentaire). L'hybridation in situ de CLV3 et de l'ARN STM a confirmé l'expansion du méristème chez les mutants della et a également montré l'expansion latérale de la niche des cellules souches (Fig. 13e, f, h, i supplémentaire). Cependant, la courbure du SAM était similaire dans les deux génotypes (Fig. 13k, m, n, p supplémentaire). Français Nous avons observé une augmentation similaire de la taille dans le mutant quadruple della gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 sans changement de courbure par rapport au type sauvage (Fig. supplémentaire 13c, d, g, j, l, o, p). La fréquence de l'orientation de la division cellulaire a également été affectée dans le mutant quadruple della, mais dans une moindre mesure que dans le mutant monolithique della (Fig. supplémentaire 12d–f). Cet effet de dosage, ainsi que l'absence d'effet sur la courbure, suggère que l'activité résiduelle de RGL3 dans le mutant quadruple Della limite les changements d'orientation de la division cellulaire causés par la perte d'activité DELLA et que les changements dans les divisions cellulaires latérales se produisent en réponse à des changements dans l'activité de signalisation GA plutôt qu'à des changements dans la géométrie SAM. Français Comme décrit ci-dessus, le promoteur CUC2 pilote l'expression d'IPR dans le SAM à partir de P4 (Fig. supplémentaire 14a, b), et en revanche, le SAM pCUC2::gai-1-VENUS avait une taille réduite mais une courbure plus élevée (Fig. supplémentaire 14c–h). Ce changement dans la morphologie du SAM pCUC2::gai-1-VENUS pourrait entraîner une distribution différente des contraintes mécaniques par rapport au type sauvage, dans lequel les contraintes circonférentielles élevées commencent à une distance plus courte du centre du SAM47. Alternativement, les changements dans la morphologie du SAM pCUC2::gai-1-VENUS pourraient résulter de modifications des propriétés mécaniques régionales induites par l'expression du transgène48. Dans les deux cas, cela pourrait compenser partiellement les effets des modifications de la signalisation GA en augmentant la probabilité que les cellules se divisent dans l'orientation circonférentielle/transversale, expliquant nos observations.
Prises ensemble, nos données confirment qu'une signalisation GA plus élevée joue un rôle actif dans l'orientation latérale du plan de division cellulaire dans l'IPR. Elles montrent également que la courbure du méristème influence également l'orientation du plan de division cellulaire dans l'IPR.
L'orientation transversale du plan de division dans l'IPR, due à une forte activité de signalisation de GA, suggère que GA pré-organise un fichier cellulaire radial dans l'épiderme au sein du SAM afin de définir l'organisation cellulaire qui sera ultérieurement trouvée dans l'entre-nœud épidermique. En effet, de tels fichiers cellulaires étaient fréquemment visibles sur les images SAM des mutants della global (Fig. 6b). Ainsi, afin d'explorer plus en détail la fonction développementale du schéma spatial de signalisation de GA dans le SAM, nous avons utilisé l'imagerie accélérée pour analyser l'organisation spatiale des cellules dans l'IPR chez des plantes sauvages (Ler et Col-0), des mutants della global et des plantes transgéniques pCUC2::gai-1-VENUS.
Français Nous avons constaté que qmRGA a montré que l'activité de signalisation GA dans l'IPR augmentait de P1/P2 et atteignait un pic à P4, et que ce schéma restait constant au fil du temps (Fig. 4a–f et Fig. 8c–f, k supplémentaires). Pour analyser l'organisation spatiale des cellules dans l'IPR avec un signal GA croissant, nous avons étiqueté les cellules IPR Ler au-dessus et sur les côtés de P4 en fonction de leur devenir développemental analysé 34 h après la première observation, c'est-à-dire plus de deux temps plastidiaux, ce qui nous a permis de suivre les cellules IPR pendant le développement du primordium de P1/P2 à P4. Nous avons utilisé trois couleurs différentes : jaune pour les cellules intégrées dans le primordium près de P4, vert pour celles qui étaient dans l'IPR et violet pour celles qui participaient aux deux processus (Fig. 7a–c). À t0 (0 h), 1 à 2 couches de cellules IPR étaient visibles devant P4 (Fig. 7a). Français Comme prévu, lorsque ces cellules se sont divisées, elles l'ont fait principalement via le plan de division transversal (Fig. 7a–c). Des résultats similaires ont été obtenus en utilisant Col-0 SAM (en se concentrant sur P3, dont la bordure se replie de manière similaire à P4 chez Ler), bien que dans ce génotype le pli formé à la bordure florale ait caché les cellules IPR plus rapidement (Fig. 7g–i). Ainsi, le modèle de division des cellules IPR pré-organise les cellules en rangées radiales, comme dans les entre-nœuds. L'organisation des rangées radiales et la localisation des cellules IPR entre les organes successifs suggèrent que ces cellules sont des progéniteurs internodaux.
Français Ici, nous avons développé un biocapteur ratiométrique de signalisation GA, qmRGA, qui permet une cartographie quantitative de l'activité de signalisation GA résultant des concentrations combinées de GA et de récepteurs GA tout en minimisant l'interférence avec les voies de signalisation endogènes, fournissant ainsi des informations sur la fonction GA au niveau cellulaire. À cette fin, nous avons construit une protéine DELLA modifiée, mRGA, qui a perdu la capacité de se lier aux partenaires d'interaction DELLA mais reste sensible à la protéolyse induite par GA. qmRGA répond aux variations exogènes et endogènes des niveaux de GA, et ses propriétés de détection dynamique permettent d'évaluer les variations spatiotemporelles de l'activité de signalisation GA au cours du développement. qmRGA est également un outil très flexible car il peut être adapté à différents tissus en changeant le promoteur utilisé pour son expression (si nécessaire), et étant donné la nature conservée de la voie de signalisation GA et du motif PFYRE chez les angiospermes, il est probable qu'il soit transférable à d'autres espèces22. Français Conformément à cela, une mutation équivalente dans la protéine DELLA SLR1 du riz (HYY497AAA) s'est également avérée supprimer l'activité répressive de croissance de SLR1 tout en ne réduisant que légèrement sa dégradation médiée par GA, similaire à mRGA23. Notamment, des études récentes chez Arabidopsis ont montré qu'une seule mutation d'acide aminé dans le domaine PFYRE (S474L) modifiait l'activité transcriptionnelle de RGA sans affecter sa capacité à interagir avec les partenaires des facteurs de transcription50. Bien que cette mutation soit très proche des 3 substitutions d'acides aminés présentes dans mRGA, nos études montrent que ces deux mutations modifient des caractéristiques distinctes de DELLA. Bien que la plupart des partenaires des facteurs de transcription se lient aux domaines LHR1 et SAW de DELLA26,51, certains acides aminés conservés dans le domaine PFYRE peuvent aider à stabiliser ces interactions.
Le développement des entre-nœuds est un trait clé de l'architecture végétale et de l'amélioration du rendement. qmRGA a révélé une activité de signalisation GA plus élevée dans les cellules progénitrices des entre-nœuds de l'IPR. En combinant l'imagerie quantitative et la génétique, nous avons montré que les schémas de signalisation GA superposent les plans de division cellulaire circulaires/transversaux dans l'épiderme du SAM, façonnant l'organisation de la division cellulaire nécessaire au développement des entre-nœuds. Plusieurs régulateurs de l'orientation du plan de division cellulaire ont été identifiés au cours du développement52,53. Nos travaux fournissent un exemple clair de la façon dont l'activité de signalisation GA régule ce paramètre cellulaire. DELLA peut interagir avec les complexes protéiques de pré-repliement41, de sorte que la signalisation GA peut réguler l'orientation du plan de division cellulaire en influençant directement l'orientation des microtubules corticaux40,41,54,55. Nous avons montré de manière inattendue que dans le SAM, le corrélat d'une activité de signalisation GA plus élevée n'était pas l'élongation ou la division cellulaire, mais uniquement l'anisotropie de la croissance, ce qui est cohérent avec un effet direct de GA sur la direction de la division cellulaire dans l'IPR. Cependant, nous ne pouvons pas exclure que cet effet puisse également être indirect, par exemple médié par le ramollissement de la paroi cellulaire induit par GA56. Les changements dans les propriétés de la paroi cellulaire induisent un stress mécanique57,58, qui peut également influencer l'orientation du plan de division cellulaire en affectant l'orientation des microtubules corticaux39,46,59. Les effets combinés du stress mécanique induit par GA et de la régulation directe de l'orientation des microtubules par GA peuvent être impliqués dans la génération d'un modèle spécifique d'orientation de la division cellulaire dans l'IPR pour définir les entre-nœuds, et d'autres études sont nécessaires pour tester cette idée. De même, des études antérieures ont souligné l'importance des protéines TCP14 et 15 interagissant avec DELLA dans le contrôle de la formation des entre-nœuds60,61 et ces facteurs peuvent médier l'action de GA avec BREVIPEDICELLUS (BP) et PENNYWISE (PNY), qui régulent le développement des entre-nœuds et dont il a été démontré qu'ils influencent la signalisation de GA2,62. Étant donné que les DELLA interagissent avec les voies de signalisation des brassinostéroïdes, de l’éthylène, de l’acide jasmonique et de l’acide abscissique (ABA)63,64 et que ces hormones peuvent influencer l’orientation des microtubules65, les effets de l’AG sur l’orientation de la division cellulaire peuvent également être médiés par d’autres hormones.
Les premières études cytologiques ont montré que les régions interne et externe du SAM d'Arabidopsis sont nécessaires au développement des entre-nœuds2,42. Le fait que GA régule activement la division cellulaire dans les tissus internes12 confirme une double fonction de GA dans la régulation de la taille des méristèmes et des entre-nœuds dans le SAM. Le modèle de division cellulaire directionnelle est également étroitement régulé dans le tissu interne du SAM, et cette régulation est essentielle à la croissance de la tige52. Il sera intéressant d'examiner si GA joue également un rôle dans l'orientation du plan de division cellulaire dans l'organisation interne du SAM, synchronisant ainsi la spécification et le développement des entre-nœuds au sein du SAM.
Français Les plantes ont été cultivées in vitro dans le sol ou dans un milieu Murashige-Skoog (MS) 1x (Duchefa) supplémenté de 1 % de saccharose et 1 % d'agar (Sigma) dans des conditions standard (16 h de lumière, 22 °C), à l'exception des expériences de croissance de l'hypocotyle et des racines dans lesquelles les semis ont été cultivés sur des plaques verticales sous lumière constante et 22 °C. Pour les expériences de nitrate, les plantes ont été cultivées sur un milieu MS modifié (milieu végétal bioWORLD) supplémenté avec un nitrate adéquat (0 ou 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-succinate, 1 % de saccharose et 1 % d'agar A (Sigma) dans des conditions de jours longs.
L'ADNc de GID1a inséré dans pDONR221 a été recombiné avec pDONR P4-P1R-pUBQ10 et pDONR P2R-P3-mCherry dans pB7m34GW pour générer pUBQ10::GID1a-mCherry. L'ADN d'IDD2 inséré dans pDONR221 a été recombiné dans pB7RWG266 pour générer p35S:IDD2-RFP. Pour générer pGID1b::2xmTQ2-GID1b, un fragment de 3,9 kb en amont de la région codante de GID1b et un fragment de 4,7 kb contenant l'ADNc de GID1b (1,3 kb) et le terminateur (3,4 kb) ont d'abord été amplifiés à l'aide des amorces du tableau supplémentaire 3, puis insérés dans pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) et pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), respectivement, et enfin recombinés avec pDONR221 2xmTQ268 dans le vecteur cible pGreen 012567 à l'aide du clonage Gateway. Français Pour générer pCUC2::LSSmOrange, la séquence promotrice CUC2 (3229 pb en amont de l'ATG) suivie de la séquence codante du grand mOrange décalé de Stokes (LSSmOrange)69 avec le signal de localisation nucléaire N7 et le terminateur transcriptionnel NOS ont été assemblées dans le vecteur de ciblage de la kanamycine pGreen en utilisant le système de recombinaison à 3 fragments Gateway (Invitrogen). Le vecteur binaire végétal a été introduit dans la souche GV3101 d'Agrobacterium tumefaciens et introduit dans les feuilles de Nicotiana benthamiana par la méthode d'infiltration d'Agrobacterium et dans Arabidopsis thaliana Col-0 par la méthode de trempage floral, respectivement. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry et pCLV3::mCherry-NLS qmRGA ont été isolés des descendances F3 et F1 des croisements respectifs, respectivement.
Français L'hybridation in situ de l'ARN a été réalisée sur des pointes de pousses d'environ 1 cm de long72, qui ont été collectées et immédiatement fixées dans une solution FAA (3,7 % de formaldéhyde, 5 % d'acide acétique, 50 % d'éthanol) pré-refroidie à 4 °C. Après 2 traitements sous vide de 15 min, le fixateur a été changé et les échantillons ont été incubés pendant la nuit. Les ADNc GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 et RGL3 et les sondes antisens de leurs 3'-UTR ont été synthétisés à l'aide des amorces présentées dans le tableau supplémentaire 3 comme décrit par Rosier et al.73. Les sondes marquées à la digoxigénine ont été immunodétectées à l'aide d'anticorps anti-digoxigénine (dilution 3000 fois ; Roche, numéro de catalogue : 11 093 274 910), et les sections ont été colorées avec une solution de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, dilution 250 fois)/nitroblue tétrazolium (NBT, dilution 200 fois).
Date de publication : 10 février 2025