Un biocapteur quantitatif de gibbérellines révèle le rôle des gibbérellines dans la spécification des entre-nœuds du méristème apical caulinaire

La croissance du méristème apical caulinaire (MAC) est essentielle à l'architecture de la tige. Hormones végétalesgibbérellinesLes gibbérellines (GA) jouent un rôle clé dans la coordination de la croissance des plantes, mais leur rôle dans le méristème apical caulinaire (MAC) reste mal compris. Nous avons développé un biocapteur ratiométrique de la signalisation des GA en modifiant la protéine DELLA afin de supprimer sa fonction régulatrice essentielle dans la réponse transcriptionnelle aux GA, tout en préservant sa dégradation suite à la reconnaissance des GA. Nous démontrons que ce biocapteur, basé sur la dégradation, enregistre avec précision les variations des niveaux de GA et la perception cellulaire au cours du développement. Nous avons utilisé ce biocapteur pour cartographier l'activité de signalisation des GA dans le MAC. Nous montrons que des signaux GA élevés sont présents principalement dans les cellules situées entre les primordia d'organes, précurseurs des cellules des entre-nœuds. Grâce à des approches de gain et de perte de fonction, nous démontrons également que les GA régulent l'orientation du plan de division cellulaire, établissant l'organisation cellulaire canonique des entre-nœuds et favorisant ainsi la spécification des entre-nœuds dans le MAC.
Le méristème apical caulinaire (MAC), situé à l'apex de la tige, contient une niche de cellules souches dont l'activité génère les organes latéraux et les nœuds caulinaires de manière modulaire et itérative tout au long de la vie de la plante. Chacune de ces unités répétitives, ou nœuds, comprend des entre-nœuds et des organes latéraux, ainsi que des méristèmes axillaires à l'aisselle des feuilles¹. La croissance et l'organisation des nœuds évoluent au cours du développement. Chez Arabidopsis, la croissance des entre-nœuds est inhibée pendant la phase végétative, et les méristèmes axillaires restent dormants à l'aisselle des feuilles en rosette. Lors de la transition vers la phase florale, le MAC se transforme en méristème inflorescentiel, générant des entre-nœuds allongés et des bourgeons axillaires, des ramifications à l'aisselle des feuilles caulinaires, et plus tard, des fleurs sans feuilles². Bien que des progrès significatifs aient été réalisés dans la compréhension des mécanismes contrôlant l'initiation des feuilles, des fleurs et des branches, la formation des entre-nœuds demeure relativement méconnue.
Comprendre la distribution spatio-temporelle des GA permettra de mieux appréhender les fonctions de ces hormones dans différents tissus et à différents stades de développement. La visualisation de la dégradation de la protéine de fusion RGA-GFP, exprimée sous le contrôle de son propre promoteur, fournit des informations importantes sur la régulation des niveaux totaux de GA dans les racines^15,16. Cependant, l'expression de RGA varie selon les tissus¹⁷ et est régulée par GA¹⁸. Ainsi, l'expression différentielle du promoteur de RGA peut expliquer le profil de fluorescence observé avec RGA-GFP, ce qui rend cette méthode non quantitative. Plus récemment, le marquage de GA à la fluorescéine (Fl)^19,20 a révélé l'accumulation de GA dans l'endocortex racinaire et la régulation de ses niveaux cellulaires par le transport des GA. Récemment, le capteur FRET de GA, nlsGPS1, a montré que les niveaux de GA sont corrélés à l'élongation cellulaire dans les racines, les filaments et les hypocotyles cultivés à l'obscurité²¹. Cependant, comme nous l'avons vu, la concentration de GA n'est pas le seul paramètre contrôlant l'activité de signalisation de la GA, car celle-ci dépend de processus de détection complexes. Dans cette étude, en nous appuyant sur notre compréhension des voies de signalisation DELLA et GA, nous présentons le développement et la caractérisation d'un biocapteur ratiométrique basé sur la dégradation pour la signalisation de la GA. Pour développer ce biocapteur quantitatif, nous avons utilisé un mutant de RGA sensible à la GA, fusionné à une protéine fluorescente et exprimé de manière ubiquitaire dans les tissus, ainsi qu'une protéine fluorescente insensible à la GA. Nous montrons que les fusions protéiques du mutant RGA n'interfèrent pas avec la signalisation endogène de la GA lorsqu'elles sont exprimées de manière ubiquitaire, et que ce biocapteur peut quantifier l'activité de signalisation résultant à la fois de l'entrée de GA et du traitement du signal GA par le système de détection, avec une haute résolution spatio-temporelle. Nous avons utilisé ce biocapteur pour cartographier la distribution spatio-temporelle de l'activité de signalisation de la GA et quantifier comment la GA régule le comportement cellulaire dans l'épiderme du méristème apical caulinaire (SAM). Nous démontrons que GA régule l'orientation du plan de division des cellules SAM situées entre les primordia d'organes, définissant ainsi l'organisation cellulaire canonique de l'internode.
Enfin, nous avons cherché à déterminer si qmRGA pouvait détecter les variations des niveaux de GA endogènes à partir d'hypocotyles en croissance. Nous avons précédemment montré que le nitrate stimule la croissance en augmentant la synthèse de GA et, par conséquent, la dégradation de DELLA34. Conformément à ces observations, la longueur des hypocotyles des plantules pUBQ10::qmRGA cultivées en présence d'une forte concentration de nitrate (10 mM NO3−) était significativement supérieure à celle des plantules cultivées en conditions de carence en nitrate (Fig. S6a). En accord avec cette réponse de croissance, les signaux GA étaient plus intenses dans les hypocotyles des plantules cultivées en présence de 10 mM NO3− que dans ceux des plantules cultivées en absence de nitrate (Fig. S6b, c). Ainsi, qmRGA permet également de suivre les variations de la signalisation GA induites par les variations de la concentration de GA endogènes.
Afin de déterminer si l'activité de signalisation des GA détectée par qmRGA dépend de la concentration et de la perception des GA, comme prévu par la conception du capteur, nous avons analysé l'expression des trois récepteurs GID1 dans les tissus végétatifs et reproducteurs. Chez les plantules, la lignée rapportrice GID1-GUS a montré une forte expression de GID1a et c dans les cotylédons (Fig. 3a–c). De plus, les trois récepteurs étaient exprimés dans les feuilles, les primordia des racines latérales, les extrémités racinaires (à l'exception de la coiffe racinaire pour GID1b) et le système vasculaire (Fig. 3a–c). Dans le méristème apical caulinaire (MAC) de l'inflorescence, nous avons détecté des signaux GUS uniquement pour GID1b et 1c (Fig. S7a–c). L'hybridation in situ a confirmé ces profils d'expression et a démontré que GID1c était exprimé uniformément à de faibles niveaux dans le MAC, tandis que GID1b présentait une expression plus élevée à la périphérie du MAC (Fig. S7d–l). La fusion translationnelle pGID1b::2xmTQ2-GID1b a également révélé une expression graduelle de GID1b, allant d'une expression faible voire nulle au centre du méristème apical caulinaire (MAC) à une forte expression aux marges de l'organe (Fig. S7m). Ainsi, les récepteurs GID1 ne sont pas distribués uniformément dans les tissus. Lors d'expériences ultérieures, nous avons également observé que la surexpression de GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) augmentait la sensibilité du qmRGA dans les hypocotyles à l'application exogène de GA (Fig. 3d, e). En revanche, la fluorescence mesurée par qd17mRGA dans l'hypocotyle était insensible au traitement par GA3 (Fig. 3f, g). Pour les deux tests, les plantules ont été traitées avec de fortes concentrations de GA (100 μM GA3) afin d'évaluer la rapidité de réponse du capteur, la capacité de liaison au récepteur GID1 étant alors augmentée ou diminuée. Ensemble, ces résultats confirment que le biocapteur qmRGA remplit une fonction combinée de capteur GA et GA, et suggèrent que l'expression différentielle du récepteur GID1 peut moduler de manière significative l'émissivité du capteur.
À ce jour, la distribution des signaux GA dans le méristème apical caulinaire (MAC) reste mal connue. C’est pourquoi nous avons utilisé des plantes exprimant qmRGA et le rapporteur de cellules souches pCLV3::mCherry-NLS³⁵ pour calculer des cartes quantitatives haute résolution de l’activité de signalisation GA, en nous concentrant sur la couche L1 (épiderme ; Fig. 4a, b, voir Méthodes et Méthodes supplémentaires), car L1 joue un rôle clé dans le contrôle de la croissance du MAC³⁶. L’expression de pCLV3::mCherry-NLS a fourni un point de référence géométrique fixe pour l’analyse de la distribution spatio-temporelle de l’activité de signalisation GA³⁷. Bien que les GA soient considérés comme essentiels au développement des organes latéraux⁴, nous avons observé que les signaux GA étaient faibles dans le primordium floral (P) à partir du stade P3 (Fig. 4a, b), tandis que les jeunes primordiums P1 et P2 présentaient une activité modérée, similaire à celle de la région centrale (Fig. 4a, b). Une activité de signalisation GA plus élevée a été détectée aux limites des primordiums d'organes, dès P1/P2 (sur les côtés de la limite) et atteignant un pic à P4, ainsi que dans toutes les cellules de la région périphérique située entre les primordiums (Fig. 4a, b et Fig. suppl. 8a, b). Cette activité de signalisation GA plus élevée a été observée non seulement dans l'épiderme, mais aussi dans les couches L2 et L3 supérieures (Fig. suppl. 8b). Le profil des signaux GA détectés dans le SAM à l'aide de qmRGA est également resté inchangé au cours du temps (Fig. suppl. 8c–f, k). Bien que la construction qd17mRGA ait été systématiquement sous-exprimée dans le SAM des plantes T3 issues de cinq lignées indépendantes que nous avons caractérisées en détail, nous avons pu analyser les profils de fluorescence obtenus avec la construction pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Fig. suppl. 8g–j, l). Dans cette lignée témoin, seules de légères variations du rapport de fluorescence ont été détectées dans le méristème apical caulinaire (MAC). Cependant, au centre du MAC, nous avons observé une diminution nette et inattendue de VENUS associée à TagBFP. Ceci confirme que le profil de signalisation observé par qmRGA reflète la dégradation de mRGA-VENUS dépendante de l'acide gibbérellique (GA), mais démontre également que qmRGA peut surestimer l'activité de signalisation GA au centre du méristème. En résumé, nos résultats révèlent un profil de signalisation GA qui reflète principalement la distribution des primordia. Cette distribution de la région inter-primordiale (RIP) est due à l'établissement progressif d'une forte activité de signalisation GA entre le primordium en développement et la région centrale, tandis que simultanément, l'activité de signalisation GA diminue dans le primordium (Fig. 4c, d).
La distribution des récepteurs GID1b et GID1c (voir ci-dessus) suggère que l'expression différentielle des récepteurs de GA contribue à moduler le profil d'activité de la signalisation GA dans le méristème apical caulinaire (MAC). Nous nous sommes interrogés sur l'implication potentielle d'une accumulation différentielle de GA. Pour explorer cette possibilité, nous avons utilisé le capteur FRET GA nlsGPS1²¹. Une augmentation de la fréquence d'activation a été observée dans le MAC de nlsGPS1 traité avec 10 μM de GA₄₊₇ pendant 100 min (Fig. S9a–e), indiquant que nlsGPS1 réagit aux variations de concentration de GA dans le MAC, comme c'est le cas dans les racines²¹. La distribution spatiale de la fréquence d'activation de nlsGPS1 a révélé des niveaux de GA relativement faibles dans les couches externes du MAC, mais élevés au centre et à la périphérie du MAC (Fig. 4e et Fig. S9a,c). Ceci suggère que la GA est également distribuée dans le MAC selon un profil spatial comparable à celui révélé par qmRGA. En complément, nous avons traité le SAM avec des GA fluorescents (GA3-, GA4-, GA7-Fl) ou avec du Fl seul comme témoin négatif. Le signal Fl était distribué dans tout le SAM, y compris dans la région centrale et le primordium, bien qu'à une intensité plus faible (Fig. 4j et Fig. S10d). En revanche, les trois GA-Fl s'accumulaient spécifiquement à la périphérie du primordium et à des degrés divers dans le reste de l'IPR, le GA7-Fl s'accumulant dans la plus grande zone de l'IPR (Fig. 4k et Fig. S10a,b). La quantification de l'intensité de fluorescence a révélé que le rapport d'intensité IPR/non-IPR était plus élevé dans le SAM traité avec GA-Fl que dans le SAM traité avec Fl (Fig. 4l et Fig. S10c). Ces résultats suggèrent que le GA est présent à des concentrations plus élevées dans les cellules de l'IPR les plus proches de la périphérie de l'organe. Cela suggère que le profil d'activité de signalisation GA du SAM résulte à la fois d'une expression différentielle des récepteurs GA et d'une accumulation différentielle de GA dans les cellules IPR proches des limites de l'organe. Ainsi, notre analyse a révélé un profil spatio-temporel inattendu de signalisation GA, avec une activité plus faible au centre et au primordium du SAM et une activité plus élevée dans l'IPR en région périphérique.
Pour comprendre le rôle de l'activité de signalisation différentielle des GA dans le SAM, nous avons analysé la corrélation entre cette activité, l'expansion cellulaire et la division cellulaire par imagerie en temps réel du SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Compte tenu du rôle des GA dans la régulation de la croissance, une corrélation positive avec les paramètres d'expansion cellulaire était attendue. Nous avons donc comparé les cartes d'activité de signalisation des GA avec les cartes de taux de croissance de la surface cellulaire (indicateur de l'intensité de l'expansion cellulaire pour une cellule donnée et pour les cellules filles lors de la division) et avec les cartes d'anisotropie de croissance, qui mesure la directionnalité de l'expansion cellulaire (également utilisée ici pour une cellule donnée et pour les cellules filles lors de la division ; Fig. 5a,b, voir Méthodes et Méthodes supplémentaires). Nos cartes de taux de croissance de la surface cellulaire du SAM sont cohérentes avec les observations précédentes^38,39, avec des taux de croissance minimaux à la périphérie et maximaux dans les fleurs en développement (Fig. 5a). L'analyse en composantes principales (ACP) a montré que l'activité de signalisation des GA était négativement corrélée à l'intensité de la croissance de la surface cellulaire (Figure 5c). Nous avons également montré que les principaux axes de variation, notamment l'intensité de la signalisation GA et la croissance, étaient orthogonaux à la direction déterminée par une forte expression de CLV3, confirmant ainsi l'exclusion des cellules du centre du SAM dans les analyses restantes. L'analyse de corrélation de Spearman a confirmé les résultats de l'ACP (Figure 5d), indiquant que des signaux GA plus élevés dans l'IPR n'entraînaient pas une expansion cellulaire plus importante. Cependant, l'analyse de corrélation a révélé une légère corrélation positive entre l'activité de signalisation GA et l'anisotropie de croissance (Figure 5c, d), suggérant qu'une signalisation GA plus intense dans l'IPR influence la direction de la croissance cellulaire et possiblement la position du plan de division cellulaire.
a, b Cartes thermiques de la croissance surfacique moyenne (a) et de l'anisotropie de croissance (b) du méristème apical caulinaire (MAC), moyennées sur sept plantes indépendantes (utilisées comme indicateurs de l'intensité et de la direction de l'expansion cellulaire, respectivement). c L'analyse en composantes principales (ACP) a inclus les variables suivantes : signal GA, intensité de croissance surfacique, anisotropie de croissance surfacique et expression de CLV3. La composante principale 1 (CP1) était principalement corrélée négativement avec l'intensité de croissance surfacique et positivement avec le signal GA. La composante principale 2 (CP2) était principalement corrélée positivement avec l'anisotropie de croissance surfacique et négativement avec l'expression de CLV3. Les pourcentages représentent la variance expliquée par chaque composante. d Analyse de corrélation de Spearman entre le signal GA, l'intensité de croissance surfacique et l'anisotropie de croissance surfacique à l'échelle tissulaire, hors zone centrale (ZC). Le nombre à droite correspond au coefficient de corrélation de Spearman (rho) entre deux variables. Les astérisques indiquent les cas où la corrélation (ou la corrélation négative) est hautement significative. e Visualisation 3D des cellules L1 du MAC de Col-0 par microscopie confocale. Les nouvelles parois cellulaires formées dans le méristème apical caulinaire (MAC), mais pas dans le primordium, à 10 h, sont colorées en fonction de leur angle. L'échelle de couleurs se trouve en bas à droite. L'encart montre l'image 3D correspondante à 0 h. L'expérience a été répétée deux fois avec des résultats similaires. Les diagrammes en boîte (f) représentent les taux de division cellulaire dans les MAC Col-0 avec et sans résistance à la pérennité (IPR) (n = 10 plantes indépendantes). La ligne centrale indique la médiane et les limites de la boîte représentent les 25e et 75e percentiles. Les barres d'erreur indiquent les valeurs minimales et maximales déterminées avec le logiciel R. Les valeurs p ont été obtenues par le test t bilatéral de Welch. Les schémas (g) et (h) montrent comment mesurer l'angle de la nouvelle paroi cellulaire (magenta) par rapport à la direction radiale à partir du centre du MAC (ligne pointillée blanche) (seules les valeurs d'angle aigu, c'est-à-dire 0–90°, sont prises en compte) et (h) les directions circonférentielle/latérale et radiale au sein du méristème. i Histogrammes de fréquence de l'orientation du plan de division cellulaire au niveau du SAM (bleu foncé), de l'IPR (bleu moyen) et en dehors de l'IPR (bleu clair). Les valeurs p ont été obtenues par un test de Kolmogorov-Smirnov bilatéral. L'expérience a été répétée deux fois avec des résultats similaires. j Histogrammes de fréquence de l'orientation du plan de division cellulaire de l'IPR autour de P3 (vert clair), P4 (vert moyen) et P5 (vert foncé). Les valeurs p ont été obtenues par un test de Kolmogorov-Smirnov bilatéral. L'expérience a été répétée deux fois avec des résultats similaires.
Nous avons donc ensuite étudié la corrélation entre la signalisation GA et l'activité de division cellulaire en identifiant les parois cellulaires nouvellement formées au cours de l'expérience (Fig. 5e). Cette approche nous a permis de mesurer la fréquence et la direction de la division cellulaire. De façon surprenante, nous avons constaté que la fréquence des divisions cellulaires dans l'IPR et le reste du SAM (non-IPR, Fig. 5f) était similaire, indiquant que les différences de signalisation GA entre les cellules IPR et non-IPR n'affectent pas significativement la division cellulaire. Ce résultat, ainsi que la corrélation positive entre la signalisation GA et l'anisotropie de croissance, nous ont incités à nous demander si l'activité de signalisation GA pouvait influencer l'orientation du plan de division cellulaire. Nous avons mesuré l'orientation de la nouvelle paroi cellulaire, exprimée par un angle aigu par rapport à l'axe radial reliant le centre du méristème au centre de la nouvelle paroi (Fig. 5e-i). Nous avons observé une nette tendance des cellules à se diviser selon des angles proches de 90° par rapport à cet axe, les fréquences les plus élevées étant observées à 70–80° (23,28 %) et 80–90° (22,62 %) (Fig. 5e,i), correspondant à des divisions cellulaires circonférentielles/transversales (Fig. 5h). Afin d'examiner la contribution de la signalisation GA à ce comportement de division cellulaire, nous avons analysé séparément les paramètres de division cellulaire dans les régions IPR et non-IPR (Fig. 5i). Nous avons observé que la distribution des angles de division dans les cellules IPR différait de celle des cellules non-IPR ou des cellules de l'ensemble du SAM, les cellules IPR présentant une proportion plus élevée de divisions cellulaires latérales/circulaires, soit 70–80° et 80–90° (33,86 % et 30,71 % respectivement) (Fig. 5i). Nos observations ont ainsi révélé une association entre une forte signalisation GA et une orientation du plan de division cellulaire proche de la direction circonférentielle, similaire à la corrélation entre l'activité de signalisation GA et l'anisotropie de croissance (Fig. 5c, d). Afin d'établir plus précisément la conservation spatiale de cette association, nous avons mesuré l'orientation du plan de division dans les cellules IPR entourant le primordium à partir de P3, car l'activité de signalisation GA la plus élevée a été détectée dans cette région à partir de P4 (Fig. 4). Les angles de division de l'IPR autour de P3 et P4 ne présentaient pas de différences statistiquement significatives, bien qu'une fréquence accrue de divisions cellulaires latérales ait été observée dans l'IPR autour de P4 (Fig. 5j). Cependant, dans les cellules de l'IPR autour de P5, la différence d'orientation du plan de division cellulaire est devenue statistiquement significative, avec une forte augmentation de la fréquence des divisions cellulaires transversales (Fig. 5j). Ces résultats suggèrent que la signalisation GA peut contrôler l'orientation des divisions cellulaires dans le SAM, ce qui est cohérent avec des études antérieures^40,41 montrant qu'une forte signalisation GA peut induire une orientation latérale des divisions cellulaires dans l'IPR.
Il est prévu que les cellules de l'IPR ne soient pas incorporées aux primordia mais plutôt aux entre-nœuds^2,42,43. L'orientation transversale des divisions cellulaires dans l'IPR pourrait expliquer l'organisation typique en rangées longitudinales parallèles de cellules épidermiques dans les entre-nœuds. Nos observations décrites précédemment suggèrent que la signalisation par les gibbérellines (GA) joue probablement un rôle dans ce processus en régulant la direction de la division cellulaire.
La perte de fonction de plusieurs gènes DELLA induit une réponse constitutive aux gibbérellines (GA), et les mutants della peuvent être utilisés pour tester cette hypothèse⁴⁴. Nous avons d'abord analysé les profils d'expression de cinq gènes DELLA dans le méristème apical caulinaire (MAC). La fusion transcriptionnelle de la lignée GUS⁴⁵ a révélé que GAI, RGA, RGL1 et RGL2 (dans une moindre mesure) étaient exprimés dans le MAC (Fig. S11a–d). L'hybridation in situ a par ailleurs démontré que l'ARNm de GAI s'accumule spécifiquement dans les primordia et les fleurs en développement (Fig. S11e). Les ARNm de RGL1 et RGL3 ont été détectés dans toute la canopée du MAC et dans les fleurs plus âgées, tandis que l'ARNm de RGL2 était plus abondant dans la région périphérique (Fig. S11f–h). L'imagerie confocale du MAC pRGL3::RGL3-GFP a confirmé l'expression observée par hybridation in situ et a montré que la protéine RGL3 s'accumule dans la partie centrale du MAC (Fig. S11i). En utilisant la lignée pRGA::GFP-RGA, nous avons également constaté que la protéine RGA s'accumule dans le méristème apical caulinaire (MAC), mais que son abondance diminue à la périphérie à partir du stade P4 (Fig. S11j). Notamment, les profils d'expression de RGL3 et RGA sont cohérents avec une activité de signalisation GA plus élevée dans la région inter-plantes (IPR), détectée par qmRGA (Fig. 4). De plus, ces données indiquent que tous les gènes DELLA sont exprimés dans le MAC et que leur expression collective s'étend sur toute la surface de ce dernier.
Nous avons ensuite analysé les paramètres de division cellulaire chez le méristème apical caulinaire (MAC) de type sauvage (Ler, témoin) et chez les mutants quintuples (globaux) gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della (Fig. 6a, b). De façon intéressante, nous avons observé un décalage statistiquement significatif dans la distribution des fréquences des angles de division cellulaire chez le mutant global della par rapport au type sauvage (Fig. 6c). Ce changement chez le mutant global della était dû à une augmentation de la fréquence des angles de 80–90° (34,71 % vs 24,55 %) et, dans une moindre mesure, des angles de 70–80° (23,78 % vs 20,18 %), c’est-à-dire correspondant à des divisions cellulaires transversales (Fig. 6c). La fréquence des divisions non transversales (0–60°) était également plus faible chez le mutant global della (Fig. 6c). La fréquence des divisions cellulaires transversales était significativement augmentée dans le méristème apical caulinaire (MAC) du mutant global della (Fig. 6b). La fréquence des divisions cellulaires transversales dans la région inter-pectorale (RIP) était également plus élevée chez le mutant global della que chez le type sauvage (Fig. 6d). En dehors de la RIP, le type sauvage présentait une distribution plus uniforme des angles de division cellulaire, tandis que le mutant global della privilégiait les divisions tangentielles, à l'instar de la RIP (Fig. 6e). Nous avons également quantifié l'orientation des divisions cellulaires dans le MAC des mutants quintuples de la ga2 oxydase (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 et ga2ox6-2), un contexte de mutation inactive de la GA dans lequel la GA s'accumule. Conformément à l'augmentation des niveaux de GA, le méristème apical caulinaire (MAC) de l'inflorescence du mutant quintuple ga2ox était plus grand que celui de Col-0 (Fig. S12a, b). De plus, comparé à Col-0, le MAC du mutant quintuple ga2ox présentait une distribution des angles de division cellulaire nettement différente, la fréquence angulaire augmentant de 50° à 90°, favorisant ainsi les divisions tangentielles (Fig. S12a–c). Nous montrons donc que l'activation constitutive de la voie de signalisation des GA et l'accumulation de GA induisent des divisions cellulaires latérales dans la région interproximale (IPR) et le reste du MAC.
a, b Visualisation 3D de la couche L1 du méristème apical caulinaire (MAC) de Ler (a) et du mutant global della (b) marqués au PI, par microscopie confocale. Les nouvelles parois cellulaires formées dans le MAC (mais pas dans le primordium) sur une période de 10 h sont représentées et colorées selon leur angle. L'encart montre le MAC à 0 h. L'échelle de couleurs est affichée dans le coin inférieur droit. La flèche en (b) indique un exemple de rangées de cellules alignées dans le mutant global della. L'expérience a été répétée deux fois avec des résultats similaires. c Comparaison de la distribution de fréquence des orientations du plan de division cellulaire dans le MAC entier (d), l'IPR (e) et le non-IPR (f) entre Ler et le mutant global della. Les valeurs p ont été obtenues à l'aide d'un test de Kolmogorov-Smirnov bilatéral. f, g Visualisation 3D d'images confocales du MAC marqué au PI de plantes transgéniques Col-0 (i) et pCUC2::gai-1-VENUS (j). Les panneaux (a, b) montrent la formation de nouvelles parois cellulaires (mais pas de primordia) dans le méristème apical caulinaire (MAC) en 10 h. L'expérience a été répétée deux fois avec des résultats similaires. h–j : Comparaison de la distribution de fréquence des orientations du plan de division cellulaire dans l'ensemble du MAC (h), la région inter-particulaire (IPR) (i) et la région non-IPR (j) entre les plantes Col-0 et pCUC2::gai-1-VENUS. Les valeurs p ont été obtenues à l'aide d'un test de Kolmogorov-Smirnov bilatéral.
Nous avons ensuite testé l'effet de l'inhibition de la signalisation GA spécifiquement dans l'IPR. À cette fin, nous avons utilisé le promoteur de cotyledon cup 2 (CUC2) pour piloter l'expression d'une protéine gai-1 dominante négative fusionnée à VENUS (dans la lignée pCUC2::gai-1-VENUS). Chez le méristème apical caulinaire (MAC) de type sauvage, le promoteur CUC2 pilote l'expression de la plupart des IPR du MAC, y compris les cellules bordantes, à partir du stade P4, et une expression spécifique similaire a été observée chez les plantes pCUC2::gai-1-VENUS (voir ci-dessous). La distribution des angles de division cellulaire dans le MAC ou l'IPR des plantes pCUC2::gai-1-VENUS n'était pas significativement différente de celle du type sauvage, bien que, de manière inattendue, nous ayons constaté que les cellules dépourvues d'IPR chez ces plantes se divisaient plus fréquemment, avec des angles de 80 à 90° (Fig. 6f–j).
Il a été suggéré que la direction de la division cellulaire dépend de la géométrie du méristème apical caulinaire (MAC), et en particulier des contraintes de traction générées par la courbure du tissu⁴⁶. Nous avons donc cherché à déterminer si la forme du MAC était altérée chez le mutant global della et chez les plantes pCUC2::gai-1-VENUS. Conformément aux observations précédentes¹², la taille du MAC du mutant global della était supérieure à celle du type sauvage (Fig. S13a, b, d). L'hybridation in situ des ARN CLV3 et STM a confirmé l'expansion du méristème chez les mutants della et a également mis en évidence l'expansion latérale de la niche des cellules souches (Fig. S13e, f, h, i). Cependant, la courbure du MAC était similaire chez les deux génotypes (Fig. S13k, m, n, p). Nous avons observé une augmentation de taille similaire chez le mutant quadruple gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della, sans modification de la courbure, par rapport au type sauvage (Fig. S13c, d, g, j, l, o, p). La fréquence d'orientation des divisions cellulaires était également affectée chez le mutant quadruple della, mais dans une moindre mesure que chez le mutant monolithique della (Fig. S12d–f). Cet effet de dosage, associé à l'absence d'effet sur la courbure, suggère que l'activité résiduelle de RGL3 chez le mutant quadruple Della limite les modifications d'orientation des divisions cellulaires induites par la perte d'activité DELLA et que les modifications des divisions cellulaires latérales sont une réponse aux variations de l'activité de signalisation GA plutôt qu'à des modifications de la géométrie du méristème apical caulinaire (SAM). Comme décrit précédemment, le promoteur CUC2 induit l'expression d'IPR dans le SAM à partir du stade P4 (Fig. S14a, b). En revanche, le SAM pCUC2::gai-1-VENUS présente une taille réduite mais une courbure plus importante (Fig. S14c–h). Cette modification morphologique du SAM pCUC2::gai-1-VENUS pourrait entraîner une distribution différente des contraintes mécaniques par rapport au type sauvage, chez lequel les fortes contraintes circonférentielles apparaissent plus près du centre du SAM⁴⁷. Une autre possibilité est que ces modifications morphologiques résultent de changements des propriétés mécaniques régionales induits par l'expression du transgène⁴⁸. Dans les deux cas, cela pourrait compenser partiellement les effets des modifications de la signalisation GA en augmentant la probabilité de division cellulaire selon une orientation circonférentielle/transversale, expliquant ainsi nos observations.
Nos données confirment que l'activation de la voie de signalisation GA joue un rôle actif dans l'orientation latérale du plan de division cellulaire au sein de l'IPR. Elles montrent également que la courbure du méristème influence cette orientation.
L'orientation transversale du plan de division dans l'IPR, due à une forte activité de signalisation des GA, suggère que les GA pré-organisent une file cellulaire radiale dans l'épiderme au sein du SAM afin de définir l'organisation cellulaire qui se retrouvera ultérieurement dans l'entre-nœud épidermique. De telles files cellulaires étaient effectivement fréquemment visibles sur les images du SAM des mutants della global (Fig. 6b). Ainsi, afin d'explorer plus avant la fonction développementale du profil spatial de signalisation des GA dans le SAM, nous avons utilisé l'imagerie en temps réel pour analyser l'organisation spatiale des cellules dans l'IPR chez des plantes de type sauvage (Ler et Col-0), des mutants della global et des plantes transgéniques pCUC2::gai-1-VENUS.
Nous avons constaté que l'analyse qmRGA montrait que l'activité de signalisation GA dans l'IPR augmentait de P1/P2 pour atteindre un pic à P4, et que ce profil restait constant au cours du temps (Fig. 4a–f et Fig. suppl. 8c–f, k). Afin d'analyser l'organisation spatiale des cellules de l'IPR en fonction de l'augmentation du signal GA, nous avons marqué les cellules Ler de l'IPR situées au-dessus et latéralement de P4 selon leur devenir développemental, analysé 34 h après la première observation, soit plus de deux fois la durée du développement du plaste. Ceci nous a permis de suivre les cellules de l'IPR au cours du développement du primordium, de P1/P2 à P4. Nous avons utilisé trois couleurs différentes : jaune pour les cellules intégrées au primordium près de P4, vert pour celles présentes dans l'IPR et violet pour celles impliquées dans les deux processus (Fig. 7a–c). À t0 (0 h), 1 à 2 couches de cellules de l'IPR étaient visibles en avant de P4 (Fig. 7a). Comme prévu, lors de leur division, ces cellules se sont principalement divisées selon le plan de division transversal (Fig. 7a–c). Des résultats similaires ont été obtenus avec le méristème apical caulinaire (SAM) de Col-0 (en se concentrant sur P3, dont le bord se replie de façon similaire à P4 chez Ler), bien que, dans ce génotype, le repli formé au bord floral ait masqué plus rapidement les cellules IPR (Fig. 7g–i). Ainsi, le mode de division des cellules IPR pré-organise ces cellules en rangées radiales, comme dans les entre-nœuds. L'organisation de ces rangées radiales et la localisation des cellules IPR entre les organes successifs suggèrent que ces cellules sont des progéniteurs internodaux.
Nous avons développé ici un biocapteur ratiométrique de signalisation GA, qmRGA, permettant la cartographie quantitative de l'activité de signalisation GA résultant des concentrations combinées de GA et de son récepteur, tout en minimisant les interférences avec les voies de signalisation endogènes. Ce biocapteur fournit ainsi des informations sur la fonction de GA au niveau cellulaire. À cette fin, nous avons construit une protéine DELLA modifiée, mRGA, qui a perdu sa capacité à se lier aux partenaires d'interaction DELLA, mais reste sensible à la protéolyse induite par GA. qmRGA répond aux variations exogènes et endogènes des niveaux de GA, et ses propriétés de détection dynamiques permettent d'évaluer les variations spatio-temporelles de l'activité de signalisation GA au cours du développement. qmRGA est également un outil très flexible, car il peut être adapté à différents tissus en modifiant le promoteur utilisé pour son expression (si nécessaire). De plus, compte tenu de la nature conservée de la voie de signalisation GA et du motif PFYRE chez les angiospermes, il est probable qu'il soit transposable à d'autres espèces²². Conformément à ces observations, une mutation équivalente dans la protéine DELLA SLR1 du riz (HYY497AAA) a également été montrée comme supprimant l'activité répressive de croissance de SLR1, tout en réduisant légèrement sa dégradation induite par les gibbérellines (GA), de manière similaire à mRGA23. Notamment, des études récentes chez Arabidopsis ont montré qu'une mutation d'un seul acide aminé dans le domaine PFYRE (S474L) modifiait l'activité transcriptionnelle de RGA sans affecter sa capacité à interagir avec ses partenaires facteurs de transcription⁵⁰. Bien que cette mutation soit très proche des trois substitutions d'acides aminés présentes dans mRGA, nos études montrent que ces deux mutations altèrent des caractéristiques distinctes de DELLA. Bien que la plupart des partenaires facteurs de transcription se lient aux domaines LHR1 et SAW de DELLA^26,51, certains acides aminés conservés dans le domaine PFYRE pourraient contribuer à stabiliser ces interactions.
Le développement des entre-nœuds est un élément clé de l'architecture végétale et de l'amélioration du rendement. L'analyse qmRGA a révélé une activité de signalisation GA plus élevée dans les cellules progénitrices des entre-nœuds IPR. En combinant l'imagerie quantitative et la génétique, nous avons montré que les profils de signalisation GA superposent des plans de division cellulaire circulaires/transversaux dans l'épiderme du méristème apical caulinaire (SAM), structurant ainsi l'organisation de la division cellulaire nécessaire au développement des entre-nœuds. Plusieurs régulateurs de l'orientation du plan de division cellulaire ont été identifiés au cours du développement^52,53. Nos travaux fournissent un exemple clair de la façon dont l'activité de signalisation GA régule ce paramètre cellulaire. DELLA peut interagir avec des complexes protéiques de pré-repliement⁴¹ ; la signalisation GA pourrait donc réguler l'orientation du plan de division cellulaire en influençant directement l'orientation des microtubules corticaux^40,41,54,55. De manière inattendue, nous avons montré que dans le SAM, le corrélat d'une activité de signalisation GA plus élevée n'était ni l'élongation ni la division cellulaire, mais uniquement l'anisotropie de croissance, ce qui est cohérent avec un effet direct de la GA sur la direction de la division cellulaire dans l'IPR. Cependant, on ne peut exclure que cet effet soit également indirect, par exemple via un ramollissement de la paroi cellulaire induit par la GA⁵⁶. Les modifications des propriétés de la paroi cellulaire induisent un stress mécanique^57,58, qui peut également influencer l'orientation du plan de division cellulaire en affectant l'orientation des microtubules corticaux^39,46,59. Les effets combinés du stress mécanique induit par la GA et de la régulation directe de l'orientation des microtubules par la GA pourraient être impliqués dans la génération d'un schéma spécifique d'orientation de la division cellulaire dans la région interproximale (IPR) pour définir les entre-nœuds ; des études complémentaires sont nécessaires pour tester cette hypothèse. De même, des études antérieures ont souligné l'importance des protéines TCP14 et 15 interagissant avec DELLA dans le contrôle de la formation des entre-nœuds^60,61, et ces facteurs pourraient intervenir dans l'action de la GA conjointement avec BREVIPEDICELLUS (BP) et PENNYWISE (PNY), qui régulent le développement des entre-nœuds et dont il a été démontré qu'ils influencent la signalisation de la GA^2,62. Étant donné que les DELLA interagissent avec les voies de signalisation des brassinostéroïdes, de l'éthylène, de l'acide jasmonique et de l'acide abscissique (ABA)63,64 et que ces hormones peuvent influencer l'orientation des microtubules65, les effets du GA sur l'orientation de la division cellulaire peuvent également être médiés par d'autres hormones.
Les premières études cytologiques ont montré que les régions interne et externe du méristème apical caulinaire (MAC) d'Arabidopsis sont toutes deux nécessaires au développement des entre-nœuds^2,42. Le fait que les gibbérellines (GA) régulent activement la division cellulaire dans les tissus internes¹² suggère une double fonction des GA dans la régulation de la taille du méristème et des entre-nœuds au sein du MAC. Le mode de division cellulaire directionnelle est également finement régulé dans le tissu interne du MAC, et cette régulation est essentielle à la croissance de la tige⁵². Il serait intéressant d'examiner si les GA jouent également un rôle dans l'orientation du plan de division cellulaire au sein de l'organisation interne du MAC, synchronisant ainsi la spécification et le développement des entre-nœuds.
Les plantes ont été cultivées in vitro dans du sol ou dans un milieu Murashige-Skoog (MS) 1x (Duchefa) supplémenté avec 1 % de saccharose et 1 % d'agar (Sigma) dans des conditions standard (16 h de lumière, 22 °C), à l'exception des expériences sur la croissance des hypocotyles et des racines, pour lesquelles les plantules ont été cultivées sur des plaques verticales sous lumière constante et à 22 °C. Pour les expériences sur les nitrates, les plantes ont été cultivées dans un milieu MS modifié (milieu bioWORLD) supplémenté avec une concentration adéquate de nitrate (0 ou 10 mM KNO3), 0,5 mM de succinate d'ammonium, 1 % de saccharose et 1 % d'agar A (Sigma) en conditions de jours longs.
L'ADNc de GID1a inséré dans pDONR221 a été recombiné avec pDONR P4-P1R-pUBQ10 et pDONR P2R-P3-mCherry dans pB7m34GW pour générer pUBQ10::GID1a-mCherry. L'ADN d'IDD2 inséré dans pDONR221 a été recombiné dans pB7RWG266 pour générer p35S:IDD2-RFP. Pour générer pGID1b::2xmTQ2-GID1b, un fragment de 3,9 kb en amont de la région codante de GID1b et un fragment de 4,7 kb contenant l'ADNc de GID1b (1,3 kb) et le terminateur (3,4 kb) ont d'abord été amplifiés à l'aide des amorces du tableau supplémentaire 3, puis insérés respectivement dans pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) et pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), et enfin recombinés avec pDONR221 2xmTQ268 dans le vecteur cible pGreen 012567 en utilisant le clonage Gateway. Pour générer pCUC2::LSSmOrange, la séquence promotrice de CUC2 (3229 pb en amont de ATG), suivie de la séquence codante de la protéine mOrange à grand décalage de Stokes (LSSmOrange)69, portant le signal de localisation nucléaire N7 et le terminateur de transcription NOS, a été assemblée dans le vecteur de ciblage à la kanamycine pGreen à l'aide du système de recombinaison Gateway à 3 fragments (Invitrogen). Le vecteur binaire végétal a été introduit dans la souche GV3101 d'Agrobacterium tumefaciens et dans les feuilles de Nicotiana benthamiana par infiltration, ainsi que dans les feuilles d'Arabidopsis thaliana Col-0 par trempage floral. Les plasmides pUBQ10::qmRGA, pUBQ10::GID1a-mCherry et pCLV3::mCherry-NLS qmRGA ont été isolés respectivement des descendances F3 et F1 des croisements respectifs.
L’hybridation in situ de l’ARN a été réalisée sur des méristèmes apicaux d’environ 1 cm de long⁷², prélevés et immédiatement fixés dans une solution FAA (3,7 % de formaldéhyde, 5 % d’acide acétique, 50 % d’éthanol) préalablement refroidie à 4 °C. Après deux traitements sous vide de 15 min chacun, le fixateur a été renouvelé et les échantillons ont été incubés pendant une nuit. Les ADNc de GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 et RGL3, ainsi que les sondes antisens correspondant à leurs régions 3′-UTR, ont été synthétisés à l’aide des amorces présentées dans le tableau supplémentaire 3, comme décrit par Rosier et al.⁷³. Les sondes marquées à la digoxigénine ont été immunodétectées à l'aide d'anticorps anti-digoxigénine (dilution 3000 fois ; Roche, numéro de catalogue : 11 093 274 910), et les sections ont été colorées avec une solution de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, dilution 250 fois)/nitrobleu tétrazolium (NBT, dilution 200 fois).