Mortalité et toxicité des préparations commerciales de cyperméthrine sur les petits têtards aquatiques

Cette étude a évalué la létalité, la sublétalité et la toxicité de produits commerciauxcyperméthrineDes formulations de cyperméthrine ont été testées sur des têtards d'anoures. Lors du test aigu, des concentrations de 100 à 800 μg/L ont été testées pendant 96 h. Lors du test chronique, la mortalité a été évaluée à des concentrations naturelles de cyperméthrine (1, 3, 6 et 20 μg/L), suivie d'un test des micronoyaux et d'une recherche d'anomalies nucléaires des globules rouges pendant 7 jours. La CL50 de la formulation commerciale de cyperméthrine chez les têtards était de 273,41 μg/L. Lors du test chronique, la concentration la plus élevée (20 μg/L) a entraîné une mortalité supérieure à 50 %, soit la moitié des têtards testés. Le test des micronoyaux a montré des résultats significatifs à 6 et 20 μg/L et plusieurs anomalies nucléaires ont été détectées, indiquant que la formulation commerciale de cyperméthrine présente un potentiel génotoxique contre P. gracilis. La cyperméthrine présente un risque élevé pour cette espèce, ce qui indique qu'elle peut engendrer de multiples problèmes et affecter la dynamique de cet écosystème à court et à long terme. Par conséquent, on peut conclure que les formulations commerciales de cyperméthrine ont des effets toxiques sur P. gracilis.
En raison de l'expansion continue des activités agricoles et de l'application intensive delutte antiparasitaireDans ces mesures, les animaux aquatiques sont fréquemment exposés aux pesticides1,2. La pollution des ressources en eau à proximité des champs agricoles peut affecter le développement et la survie des organismes non ciblés tels que les amphibiens.
Les amphibiens jouent un rôle de plus en plus important dans l'évaluation des matrices environnementales. Les anoures sont considérés comme de bons bioindicateurs de la pollution environnementale en raison de leurs caractéristiques uniques, telles que leurs cycles de vie complexes, leur croissance larvaire rapide, leur statut trophique, leur peau perméable^10,11, leur dépendance à l'eau pour la reproduction¹² et leurs œufs non protégés^11,13,14. La petite grenouille d'eau (Physalaemus gracilis), communément appelée grenouille pleureuse, s'est révélée être une espèce bioindicatrice de la pollution par les pesticides^4,5,6,7,15. Cette espèce se rencontre dans les eaux stagnantes, les aires protégées ou les zones à habitat variable en Argentine, en Uruguay, au Paraguay et au Brésil^16,17 et est considérée comme stable par la classification de l'UICN en raison de sa large distribution et de sa tolérance à différents habitats¹⁸.
Des effets sublétaux ont été observés chez les amphibiens exposés à la cyperméthrine, notamment des modifications comportementales, morphologiques et biochimiques chez les têtards^23,24,25, une altération de la mortalité et de la durée de la métamorphose, des modifications enzymatiques, une diminution du taux d'éclosion^24,25, une hyperactivité²⁶, une inhibition de l'activité de la cholinestérase²⁷ et des changements dans les performances de nage^7,28. Cependant, les études sur les effets génotoxiques de la cyperméthrine chez les amphibiens sont peu nombreuses. Il est donc important d'évaluer la sensibilité des espèces d'anoures à la cyperméthrine.
La pollution environnementale affecte la croissance et le développement normaux des amphibiens, mais l'effet néfaste le plus grave est l'altération de leur ADN due à l'exposition aux pesticides¹³. L'analyse morphologique des cellules sanguines est un bioindicateur important de la pollution et de la toxicité potentielle d'une substance pour les espèces sauvages²⁹. Le test des micronoyaux est l'une des méthodes les plus couramment utilisées pour déterminer la génotoxicité des produits chimiques dans l'environnement³⁰. C'est une méthode rapide, efficace et peu coûteuse qui constitue un bon indicateur de la pollution chimique d'organismes tels que les amphibiens^31,32 et peut fournir des informations sur l'exposition à des polluants génotoxiques³³.
L’objectif de cette étude était d’évaluer le potentiel toxique des formulations commerciales de cyperméthrine sur les petits têtards aquatiques à l’aide d’un test de micronoyaux et d’une évaluation des risques écologiques.
Mortalité cumulée (%) des têtards de P. gracilis exposés à différentes concentrations de cyperméthrine commerciale pendant la période aiguë du test.
Mortalité cumulée (%) des têtards de P. gracilis exposés à différentes concentrations de cyperméthrine commerciale au cours d'un test chronique.
La forte mortalité observée était due à des effets génotoxiques chez les amphibiens exposés à différentes concentrations de cyperméthrine (6 et 20 μg/L), comme en témoignent la présence de micronoyaux (MN) et d'anomalies nucléaires dans les érythrocytes. La formation de MN indique des erreurs de mitose et est associée à une mauvaise fixation des chromosomes aux microtubules, à des défauts des complexes protéiques responsables de l'internalisation et du transport des chromosomes, à des erreurs de ségrégation chromosomique et à des erreurs de réparation des lésions de l'ADN^38,39, et pourrait être liée à un stress oxydatif induit par le pesticide^40,41. D'autres anomalies ont été observées à toutes les concentrations évaluées. L'augmentation des concentrations de cyperméthrine a entraîné une augmentation des anomalies nucléaires dans les érythrocytes de 5 % et 20 % aux doses les plus faibles (1 μg/L) et les plus élevées (20 μg/L), respectivement. Par exemple, des modifications de l'ADN d'une espèce peuvent avoir de graves conséquences sur sa survie à court et à long terme, entraînant un déclin de la population, une altération de la capacité de reproduction, la consanguinité, une perte de diversité génétique et une modification des taux de migration. Tous ces facteurs peuvent impacter la survie et le maintien des espèces^42,43. La formation d'anomalies érythroïdes peut indiquer un blocage de la cytocinèse, provoquant une division cellulaire anormale (érythrocytes binucléés)^44,45 ; les noyaux multilobés sont des protrusions de la membrane nucléaire présentant de multiples lobes⁴⁶, tandis que d'autres anomalies érythroïdes peuvent être associées à une amplification de l'ADN, telles que les « reins nucléaires » ou les vésicules⁴⁷. La présence d'érythrocytes anucléés peut indiquer une altération du transport d'oxygène, notamment dans les eaux contaminées^48,49. L'apoptose désigne la mort cellulaire⁵⁰.
D'autres études ont également démontré les effets génotoxiques de la cyperméthrine. Kabaña et al.⁵¹ ont mis en évidence la présence de micronoyaux et d'altérations nucléaires, telles que des cellules binucléées et des cellules apoptotiques, chez Odontophrynus americanus après une exposition de 96 h à de fortes concentrations de cyperméthrine (5 000 et 10 000 μg L⁻¹). L'apoptose induite par la cyperméthrine a également été observée chez P. biligonigerus⁵² et Rhinella arenarum⁵³. Ces résultats suggèrent que la cyperméthrine exerce des effets génotoxiques sur divers organismes aquatiques et que les tests MN et ENA pourraient servir d'indicateurs d'effets sublétaux sur les amphibiens et être applicables aux espèces indigènes et aux populations sauvages exposées à des substances toxiques¹².
Les formulations commerciales de cyperméthrine présentent un risque environnemental élevé (à la fois aigu et chronique), avec des quotients de risque (QR) supérieurs au seuil fixé par l'Agence américaine de protection de l'environnement (EPA)⁵⁴, ce qui peut nuire aux espèces si elles sont présentes dans l'environnement. Lors de l'évaluation du risque chronique, la concentration sans effet nocif observé (CSEO) pour la mortalité était de 3 μg L⁻¹, confirmant que les concentrations trouvées dans l'eau peuvent présenter un risque pour les espèces⁵⁵. La CSEO létale pour les larves de R. arenarum exposées à un mélange d'endosulfan et de cyperméthrine était de 500 μg L⁻¹ après 168 h ; cette valeur a diminué à 0,0005 μg L⁻¹ après 336 h. Les auteurs montrent que plus l'exposition est longue, plus les concentrations nocives pour les espèces sont faibles. Il est également important de souligner que les valeurs de CSEO étaient supérieures à celles de P. gracilis pour une même durée d'exposition, indiquant que la réponse des espèces à la cyperméthrine est spécifique à chaque espèce. De plus, en termes de mortalité, l'indice CHQ de *P. gracilis* après exposition à la cyperméthrine a atteint 64,67, une valeur supérieure à la valeur de référence fixée par l'Agence américaine de protection de l'environnement (EPA)⁵⁴. L'indice CHQ des larves de *R. arenarum* était également supérieur à cette valeur (CHQ > 388,00 après 336 h), ce qui indique que les insecticides étudiés présentent un risque élevé pour plusieurs espèces d'amphibiens. Sachant que *P. gracilis* nécessite environ 30 jours pour achever sa métamorphose⁵⁶, on peut conclure que les concentrations de cyperméthrine étudiées pourraient contribuer au déclin de la population en empêchant les individus infectés d'atteindre le stade adulte ou reproducteur à un âge précoce.
Dans l'évaluation des risques liés aux micronoyaux et autres anomalies nucléaires des érythrocytes, les valeurs de CHQ variaient de 14,92 à 97,00, indiquant un risque génotoxique potentiel de la cyperméthrine pour *P. gracilis*, même dans son habitat naturel. En tenant compte de la mortalité, la concentration maximale tolérée de composés xénobiotiques pour *P. gracilis* était de 4,24 μg L⁻¹. Cependant, des concentrations aussi faibles que 1 μg/L ont également montré des effets génotoxiques. Ce phénomène pourrait entraîner une augmentation du nombre d'individus anormaux⁵⁷ et affecter le développement et la reproduction des espèces dans leurs habitats, conduisant ainsi à un déclin des populations d'amphibiens.
Les formulations commerciales de l'insecticide cyperméthrine ont présenté une toxicité aiguë et chronique élevée chez *P. gracilis*. Des taux de mortalité plus élevés ont été observés, probablement dus à des effets toxiques, comme en témoignent la présence de micronoyaux et d'anomalies nucléaires des érythrocytes, notamment des noyaux dentelés, lobés et vésiculaires. De plus, l'espèce étudiée a présenté des risques environnementaux accrus, tant aigus que chroniques. Ces données, combinées à des études antérieures de notre groupe de recherche, ont montré que même différentes formulations commerciales de cyperméthrine entraînaient une diminution de l'activité de l'acétylcholinestérase (AChE) et de la butyrylcholinestérase (BChE), ainsi qu'un stress oxydatif⁵⁸, et induisaient des modifications de la nage et des malformations buccales⁵⁹ chez *P. gracilis*, indiquant que les formulations commerciales de cyperméthrine présentent une toxicité létale et sublétale élevée pour cette espèce. (Hartmann et al.) Soixante études ont montré que les formulations commerciales de cyperméthrine étaient les plus toxiques pour P. gracilis et une autre espèce du même genre (P. cuvieri), comparativement à neuf autres pesticides. Cela laisse supposer que les concentrations de cyperméthrine autorisées pour la protection de l'environnement pourraient entraîner une forte mortalité et un déclin à long terme des populations.
Des études complémentaires sont nécessaires pour évaluer la toxicité de ce pesticide pour les amphibiens, car les concentrations relevées dans l'environnement pourraient entraîner une forte mortalité et présenter un risque potentiel pour le papillon P. gracilis. La recherche sur les espèces d'amphibiens devrait être encouragée, car les données les concernant sont rares, notamment sur les espèces brésiliennes.
Le test de toxicité chronique a duré 168 h (7 jours) en conditions statiques. Les concentrations sublétales étaient de 1, 3, 6 et 20 μg de matière active L⁻¹. Dans les deux expériences, 10 têtards par groupe de traitement ont été évalués, avec six répétitions, soit un total de 60 têtards par concentration. Un traitement à l'eau seule a servi de témoin négatif. Chaque dispositif expérimental était constitué d'une boîte de Petri en verre stérile d'une capacité de 500 ml, contenant 1 têtard pour 50 ml de solution. La boîte était recouverte d'un film de polyéthylène pour limiter l'évaporation et était aérée en continu.
L'eau a été analysée chimiquement afin de déterminer les concentrations de pesticides à 0, 96 et 168 h. Conformément aux travaux de Sabin et al.⁶⁸ et de Martins et al.⁶⁹, les analyses ont été réalisées au Laboratoire d'analyse des pesticides (LARP) de l'Université fédérale de Santa Maria par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse à triple quadripôle (Varian, modèle 1200, Palo Alto, Californie, États-Unis). Le dosage des pesticides dans l'eau est présenté en annexe (tableau SM1).
Pour le test des micronoyaux (TMN) et le test des anomalies nucléaires des globules rouges (ARN), 15 têtards de chaque groupe de traitement ont été analysés. Les têtards ont été anesthésiés avec de la lidocaïne à 5 % (50 mg/g) et des échantillons de sang ont été prélevés par ponction cardiaque à l'aide de seringues héparinées à usage unique. Des frottis sanguins ont été préparés sur des lames de microscope stériles, séchés à l'air, fixés avec du méthanol à 100 % (4 °C) pendant 2 min, puis colorés avec une solution de Giemsa à 10 % pendant 15 min à l'obscurité. À la fin du processus, les lames ont été rincées à l'eau distillée pour éliminer l'excès de colorant et séchées à température ambiante.
Au moins 1 000 globules rouges de chaque têtard ont été analysés au microscope (grossissement 100×, objectif 71) afin de déterminer la présence de micronoyaux (MN) et d’antigènes nucléaires endogènes (ENA). Au total, 75 796 globules rouges de têtards ont été évalués en fonction des concentrations de cyperméthrine et des témoins. La génotoxicité a été analysée selon la méthode de Carrasco et al. et Fenech et al.^38,72 en déterminant la fréquence des lésions nucléaires suivantes : (1) cellules anucléées : cellules sans noyau ; (2) cellules apoptotiques : fragmentation nucléaire, mort cellulaire programmée ; (3) cellules binucléées : cellules à deux noyaux ; (4) cellules à bourgeons nucléaires ou à protrusions : cellules dont le noyau présente de petites protrusions de la membrane nucléaire, des protrusions de taille similaire à celle des micronoyaux ; (5) cellules caryolysées : cellules ne conservant que le contour du noyau, sans contenu interne. (6) Cellules échancrées : cellules dont le noyau présente des fissures ou des échancrures marquées, également appelées noyaux réniformes ; (7) cellules lobulées : cellules dont les protrusions nucléaires sont plus grandes que les vésicules mentionnées précédemment ; et (8) microcellules : cellules à noyau condensé et à cytoplasme réduit. Les modifications ont été comparées aux résultats du témoin négatif.
Les résultats des tests de toxicité aiguë (CL50) ont été analysés à l'aide du logiciel GBasic et de la méthode TSK-Trimmed Spearman-Karber⁷⁴. Les données des tests de toxicité chronique ont été préalablement testées pour la normalité des erreurs (test de Shapiro-Wilk) et l'homogénéité des variances (test de Bartlett). Les résultats ont été analysés par une analyse de variance à un facteur (ANOVA). Le test de Tukey a été utilisé pour comparer les données entre elles, et le test de Dunnett pour comparer les données entre le groupe traité et le groupe témoin négatif.
Les données LOEC et NOEC ont été analysées à l'aide du test de Dunnett. Les tests statistiques ont été réalisés avec le logiciel Statistica 8.0 (StatSoft) avec un seuil de signification de 95 % (p < 0,05).