Matériel végétal et pathogène
Une population de sorgho pour la cartographie des associations, appelée population de conversion du sorgho (SCP), a été fournie par le Dr Pat Brown de l'Université de l'Illinois (aujourd'hui UC Davis). Déjà décrite, elle regroupe diverses lignées converties à l'insensibilité à la photopériode et à une taille plus petite pour faciliter la croissance et le développement des plantes dans les environnements américains. 510 lignées de cette population ont été utilisées dans cette étude. Cependant, en raison d'une mauvaise germination et d'autres problèmes de contrôle qualité, toutes les lignées n'ont pas été utilisées pour l'analyse des trois caractères. Au final, les données de 345 lignées ont été utilisées pour l'analyse de la réponse à la chitine, 472 pour la réponse flg22 et 456 pour la résistance au TLS.B. cookeila souche LSLP18 a été obtenue auprès du Dr Burt Bluhm de l'Université de l'Arkansas.
Mesure de la réponse MAMP
Deux MAMP différents ont été utilisés dans cette étude : flg22 (catalogue Genscript n° RP19986) et chitine. Les plants de sorgho ont été cultivés en serre dans des inserts posés sur des plateaux remplis de terre (33 % de Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix). Les plants ont été arrosés la veille du prélèvement afin d'éviter une humidité excessive des feuilles le jour même.
Les lignées ont été randomisées et, pour des raisons logistiques, plantées par lots de 60 lignées. Pour chaque lignée, trois « pots » ont été plantés avec deux graines par lignée. Les lots suivants ont été plantés dès que le lot précédent avait été traité, jusqu'à ce que la population entière ait été évaluée. Deux essais expérimentaux ont été réalisés pour les deux MAMP, les génotypes étant à nouveau randomisés lors de chacun des deux essais.
Les dosages ROS ont été réalisés comme décrit précédemment. En bref, pour chaque lignée, six graines ont été semées dans trois pots différents. Parmi les semis obtenus, trois ont été sélectionnés pour leur uniformité. Les semis présentant un aspect inhabituel ou significativement plus grands ou plus petits que la majorité n'ont pas été utilisés. Quatre disques foliaires de 3 mm de diamètre ont été prélevés sur la partie la plus large de la quatrième feuille de trois plants de sorgho différents âgés de 15 jours. Un disque par feuille pour deux plants et deux disques pour un plant, le second disque servant de témoin hydrique (voir ci-dessous). Les disques ont été placés individuellement sur 50 µl d'eau dans une plaque noire à 96 puits, scellés avec un opercule en aluminium pour éviter toute exposition à la lumière, et conservés à température ambiante pendant la nuit. Le lendemain matin, une solution réactionnelle a été préparée à partir de 2 mg/ml de sonde chimioluminescente L-012 (Wako, catalogue n° 120-04891), 2 mg/ml de peroxydase de raifort (Type VI-A, Sigma-Aldrich, catalogue n° P6782) et 100 mg/ml de chitine ou 2 μM de Flg22. 50 µl de cette solution réactionnelle ont été ajoutés à trois des quatre puits. Le quatrième puits était un témoin factice, auquel la solution réactionnelle sans MAMP a été ajoutée. Quatre puits blancs contenant uniquement de l'eau ont également été inclus dans chaque plaque.
Après ajout de la solution réactionnelle, la luminescence a été mesurée à l'aide du lecteur de microplaques multi-détection SynergyTM 2 (BioTek) toutes les 2 minutes pendant 1 heure. Le lecteur de plaques mesure la luminescence toutes les 2 minutes pendant cette heure. La somme des 31 mesures a été calculée pour obtenir la valeur de chaque puits. La valeur estimée de la réponse MAMP pour chaque génotype a été calculée comme suit : (valeur de luminescence moyenne des trois puits expérimentaux – valeur du puits témoin) – moins la valeur moyenne du puits témoin. Les valeurs des puits témoins étaient systématiquement proches de zéro.
Disques de feuilles deNicotiana benthamiana, une lignée de sorgho à haute réactivité (SC0003) et une lignée de sorgho à faible réactivité (PI 6069) ont également été incluses comme témoins dans chaque plaque à 96 puits à des fins de contrôle qualité.
B. cookeipréparation et inoculation de l'inoculum
B. cookeiL'inoculum a été préparé comme décrit précédemment. En bref, les grains de sorgho ont été trempés dans l'eau pendant trois jours, rincés, puis placés dans des fioles coniques de 1 L et autoclavés pendant une heure à 15 psi et 121 °C. Les grains ont ensuite été inoculés avec environ 5 ml de mycélium macéré provenant d'une culture fraîche deB. cookeiLes isolats LSLP18 ont été laissés deux semaines à température ambiante, en agitant les flacons tous les trois jours. Après deux semaines, les grains de sorgho infestés par le champignon ont été séchés à l'air libre, puis conservés à 4 °C jusqu'à l'inoculation au champ. Le même inoculum a été utilisé pendant toute la durée de l'essai et renouvelé chaque année. Pour l'inoculation, 6 à 10 grains infestés ont été placés dans le verticille de plants de sorgho âgés de 4 à 5 semaines. Les spores produites par ces champignons ont initié l'infection des jeunes plants de sorgho en une semaine.
Préparation des semences
Avant la plantation, les semences de sorgho ont été traitées avec un mélange fongicide, insecticide et phytoprotecteur contenant environ 1 % de fongicide Spirato 480 FS, 4 % de fongicide Sebring 480 FS et 3 % de phytoprotecteur Sorpro 940 ES. Les graines ont ensuite été séchées à l'air libre pendant 3 jours, ce qui a permis d'obtenir une fine couche de ce mélange autour d'elles. Le phytoprotecteur a permis l'utilisation de l'herbicide Dual Magnum en traitement de pré-levée.
Évaluation de la résistance à la tache foliaire cible
Le SCP a été planté à la Central Crops Research Station de Clayton, en Caroline du Nord, les 14 et 15 juin 2017 et le 20 juin 2018, selon un dispositif en blocs randomisés complets, avec deux répétitions expérimentales dans chaque cas. Les expériences ont été plantées en rangs simples de 1,8 m avec une largeur de rang de 0,9 m, en utilisant 10 graines par parcelle. Deux rangs de bordure ont été plantés en périphérie de chaque expérience pour éviter les effets de bordure. Les expériences ont été inoculées les 20 juillet 2017 et 20 juillet 2018, date à laquelle les plants de sorgho étaient au stade de croissance 3. Les notes ont été prises sur une échelle de un à neuf, où les plants ne présentant aucun signe de maladie ont été notés neuf et les plants complètement morts ont été notés un. Deux notes ont été prises en 2017 et quatre lectures en 2018, commençant deux semaines après l'inoculation chaque année. La sAUDPC (aire standardisée sous la courbe de progression de la maladie) a été calculée comme décrit précédemment.
Date de publication : 01/04/2021