Matériel végétal et pathogène
Une population de cartographie d'associations de sorgho, connue sous le nom de population de conversion du sorgho (SCP), a été fournie par le Dr Pat Brown de l'Université de l'Illinois (désormais à l'UC Davis). Déjà décrite, cette population est un ensemble de lignées diverses converties pour être insensibles à la photopériode et de plus petite taille, afin de faciliter la croissance et le développement des plantes dans les conditions climatiques américaines. 510 lignées de cette population ont été utilisées dans cette étude. Cependant, en raison de problèmes de germination et d'autres difficultés de contrôle qualité, toutes les lignées n'ont pas pu être utilisées pour l'analyse des trois caractères. Au final, les données de 345 lignées ont été utilisées pour l'analyse de la réponse à la chitine, celles de 472 lignées pour la réponse au flg22 et celles de 456 lignées pour la résistance au TLS.B. cookeiLa souche LSLP18 a été obtenue auprès du Dr Burt Bluhm de l'Université de l'Arkansas.
mesure de la réponse MAMP
Deux MAMP différents ont été utilisés dans cette étude : le flg22 (référence Genscript : RP19986) et la chitine. Les plants de sorgho ont été cultivés en serre dans des inserts placés sur des plateaux remplis de terreau (33 % de mélange de culture Sunshine Redi-Earth Pro). Les plants ont été arrosés la veille du prélèvement des échantillons afin d’éviter un excès d’humidité foliaire le jour du prélèvement.
Les lignées ont été randomisées et, pour des raisons logistiques, semées par lots de 60. Chaque lignée a été semée dans trois pots contenant chacun deux graines. Les lots suivants ont été semés dès que le lot précédent a été traité, et ce jusqu'à ce que la population entière ait été évaluée. Deux essais ont été menés pour chaque MAMP, les génotypes étant à nouveau randomisés lors de chaque essai.
Les dosages de ROS ont été réalisés selon le protocole décrit précédemment. Brièvement, pour chaque lignée, six graines ont été semées dans trois pots différents. Parmi les plantules obtenues, trois ont été sélectionnées en fonction de leur homogénéité. Les plantules d'apparence inhabituelle ou significativement plus grandes ou plus petites que la majorité ont été exclues. Quatre disques foliaires de 3 mm de diamètre ont été prélevés sur la partie la plus large de la quatrième feuille de trois plants de sorgho différents âgés de 15 jours. Un disque par feuille a été prélevé sur deux plants et deux disques sur un plant, le second disque servant de témoin négatif (voir ci-dessous). Les disques ont été placés individuellement à la surface de 50 µl d'eau dans une plaque noire à 96 puits, scellée avec un film d'aluminium pour la protéger de la lumière, et incubée à température ambiante pendant une nuit. Le lendemain matin, une solution réactionnelle a été préparée avec 2 mg/ml de sonde chimioluminescente L-012 (Wako, réf. 120-04891), 2 mg/ml de peroxydase de raifort (type VI-A, Sigma-Aldrich, réf. P6782) et 100 mg/ml de chitine ou 2 µM de Flg22. 50 µl de cette solution réactionnelle ont été ajoutés à trois des quatre puits. Le quatrième puits servait de témoin négatif : la solution réactionnelle sans MAMP y était ajoutée. Quatre puits blancs contenant uniquement de l’eau ont également été inclus dans chaque plaque.
Après l'ajout de la solution réactionnelle, la luminescence a été mesurée toutes les 2 minutes pendant 1 heure à l'aide d'un lecteur de microplaques multidétection Synergy™ 2 (BioTek). La somme des 31 mesures a permis d'obtenir la valeur de chaque puits. La valeur estimée de la réponse MAMP pour chaque génotype a été calculée comme suit : (valeur moyenne de luminescence des trois puits expérimentaux – valeur du puits témoin négatif) – valeur moyenne du puits blanc. Les valeurs des puits blancs étaient systématiquement proches de zéro.
Disques foliaires deNicotiana benthamiana, une lignée de sorgho à forte réactivité (SC0003) et une lignée de sorgho à faible réactivité (PI 6069) ont également été incluses comme témoins dans chaque plaque de 96 puits à des fins de contrôle de la qualité.
B. cookeipréparation et inoculation de l'inoculum
B. cookeiL'inoculum a été préparé comme décrit précédemment. Brièvement, les grains de sorgho ont été trempés dans l'eau pendant trois jours, rincés, prélevés et placés dans des flacons coniques de 1 L, puis autoclavés pendant une heure à 15 psi et 121 °C. Les grains ont ensuite été inoculés avec environ 5 ml de mycélium macéré provenant d'une culture fraîche deB. cookeiLes isolats de LSLP18 ont été cultivés pendant deux semaines à température ambiante, en agitant les flacons tous les trois jours. Après deux semaines, les grains de sorgho infestés par le champignon ont été séchés à l'air libre puis conservés à 4 °C jusqu'à l'inoculation au champ. Le même inoculum a été utilisé pour toute la durée de l'essai et préparé chaque année. Pour l'inoculation, 6 à 10 grains infestés ont été placés dans le cœur de plants de sorgho âgés de 4 à 5 semaines. Les spores produites par ce champignon ont initié l'infection des jeunes plants de sorgho en une semaine.
préparation des semences
Avant le semis, les semences de sorgho ont été traitées avec un mélange fongicide, insecticide et protecteur contenant environ 1 % de fongicide Spirato 480 FS, 4 % de fongicide Sebring 480 FS et 3 % de protecteur de semences Sorpro 940 ES. Elles ont ensuite été séchées à l'air libre pendant trois jours, ce qui a permis de les enrober d'une fine couche de ce mélange. Le protecteur a rendu possible l'application de l'herbicide Dual Magnum en pré-levée.
Évaluation de la résistance à la tache foliaire ciblée
Le SCP a été semé à la Station centrale de recherche sur les cultures de Clayton, en Caroline du Nord, les 14 et 15 juin 2017 et le 20 juin 2018, selon un dispositif en blocs complets randomisés avec deux répétitions expérimentales. Les parcelles ont été semées en rangs simples de 1,8 m de large et espacés de 0,9 m, à raison de 10 graines par parcelle. Deux rangs de bordure ont été semés en périphérie de chaque parcelle afin de limiter les effets de lisière. L'inoculation a eu lieu le 20 juillet 2017 et le 20 juillet 2018, lorsque les plants de sorgho étaient au stade de croissance 3. L'évaluation a été réalisée sur une échelle de 1 à 9, 9 correspondant à des plants ne présentant aucun signe de maladie et 1 à des plants complètement morts. Deux évaluations ont été effectuées en 2017 et quatre en 2018, à partir de deux semaines après l'inoculation chaque année. L'aire sous la courbe de progression de la maladie (sAUDPC) a été calculée selon la méthode décrite précédemment.
Date de publication : 1er avril 2021