Le nématode du pin est un endoparasite migrateur de quarantaine connu pour causer de graves pertes économiques dans les écosystèmes forestiers de pins. La présente étude examine l'activité nématicide des indoles halogénés contre les nématodes du pin et leur mécanisme d'action. Les activités nématicides du 5-iodoindole et de l'avermectine (témoin positif) contre les nématodes du pin étaient similaires et élevées à de faibles concentrations (10 μg/mL). Le 5-iodoindole a réduit la fécondité, l'activité reproductive, la mortalité embryonnaire et larvaire, et le comportement locomoteur. Les interactions moléculaires des ligands avec les récepteurs des canaux chlorure glutamate-dépendants spécifiques des invertébrés soutiennent l'idée que le 5-iodoindole, comme l'avermectine, se lie étroitement au site actif du récepteur. Le 5-iodoindole a également induit diverses déformations phénotypiques chez les nématodes, notamment un effondrement/rétrécissement anormal des organes et une vacuolisation accrue. Ces résultats suggèrent que les vacuoles pourraient jouer un rôle dans la mort induite par la méthylation des nématodes. Il est important de noter que le 5-iodoindole s'est avéré non toxique pour les deux espèces végétales (chou et radis). Ainsi, cette étude démontre que l'application d'iodoindole dans des conditions environnementales favorables peut contrôler les lésions dues au flétrissement du pin.
Le nématode du pin (Bursaphelenchus xylophilus) appartient à la famille des nématodes du pin (PWN), des nématodes endoparasites migrateurs connus pour causer de graves dommages écologiques aux écosystèmes forestiers de pins1. La maladie du flétrissement du pin (PWD), causée par le nématode du pin, devient un problème grave sur plusieurs continents, notamment en Asie et en Europe. En Amérique du Nord, le nématode détruit les espèces de pins introduites1,2. Le dépérissement des pins est un problème économique majeur, et la perspective de sa propagation mondiale est inquiétante3. Les espèces de pins suivantes sont les plus fréquemment attaquées par le nématode : Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii et Pinus radiata4. Le nématode du pin est une maladie grave qui peut tuer les pins en quelques semaines ou mois après l'infection. De plus, les épidémies de nématodes du pin sont courantes dans divers écosystèmes, de sorte que des chaînes d’infection persistantes ont été établies1.
Bursaphelenchus xylophilus est un nématode phytoparasite de quarantaine appartenant à la superfamille des Aphelenchoidea et au clade 102.5. Ce nématode se nourrit de champignons et se reproduit dans les tissus ligneux des pins, se développant en quatre stades larvaires différents : L1, L2, L3, L4 et un individu adulte1,6. En cas de pénurie alimentaire, le nématode du pin passe à un stade larvaire spécialisé – le dauer – qui parasite son vecteur, le scolyte du pin (Monochamus alternatus), et est transféré aux pins sains. Chez les hôtes sains, les nématodes migrent rapidement à travers les tissus végétaux et se nourrissent de cellules parenchymateuses, ce qui entraîne plusieurs réactions d’hypersensibilité, le flétrissement du pin et la mort dans l’année suivant l’infection1,7,8.
La lutte biologique contre les nématodes du pin a longtemps été un défi, les mesures de quarantaine remontant au XXe siècle. Les stratégies actuelles de lutte contre les nématodes du pin reposent principalement sur des traitements chimiques, notamment la fumigation du bois et l'implantation de nématicides dans les troncs d'arbres. Les nématicides les plus couramment utilisés sont l'avermectine et le benzoate d'avermectine, qui appartiennent à la famille des avermectines. Ces produits chimiques coûteux sont très efficaces contre de nombreuses espèces de nématodes et sont considérés comme sans danger pour l'environnement9. Cependant, l'utilisation répétée de ces nématicides devrait créer une pression sélective qui conduira presque certainement à l'émergence de nématodes du pin résistants, comme cela a été démontré pour plusieurs insectes ravageurs, tels que Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella et les nématodes Trichostrongylus colubriformis et Ostertagia circumcincta, qui ont progressivement développé une résistance aux avermectines10,11,12. Par conséquent, les profils de résistance doivent être régulièrement étudiés et les nématicides testés en permanence afin de trouver des mesures alternatives, rentables et respectueuses de l'environnement pour lutter contre la maladie du PVD. Ces dernières décennies, plusieurs auteurs ont proposé l'utilisation d'extraits de plantes, d'huiles essentielles et de composés volatils comme agents de lutte contre les nématodes13,14,15,16.
Français Nous avons récemment démontré l'activité nématicide de l'indole, une molécule de signalisation intercellulaire et inter-règne, chez Caenorhabditis elegans 17 . L'indole est un signal intracellulaire répandu dans l'écologie microbienne, contrôlant de nombreuses fonctions qui affectent la physiologie microbienne, la formation de spores, la stabilité des plasmides, la résistance aux médicaments, la formation de biofilms et la virulence 18, 19 . L'activité de l'indole et de ses dérivés contre d'autres nématodes pathogènes n'a pas été étudiée. Dans cette étude, nous avons étudié l'activité nématicide de 34 indoles contre les nématodes du pin et élucidé le mécanisme d'action du 5-iodoindole le plus puissant en utilisant la microscopie, la photographie en accéléré et des expériences d'amarrage moléculaire, et évalué ses effets toxiques sur les plantes en utilisant un test de germination des graines.
Français Des concentrations élevées (> 1,0 mM) d'indole ont été précédemment rapportées comme ayant un effet nématicide sur les nématodes17. Après traitement de B. xylophilus (stades de vie mixtes) avec de l'indole ou 33 dérivés d'indole différents à 1 mM, la mortalité de B. xylophilus a été mesurée en comptant les nématodes vivants et morts dans les groupes témoin et traité. Cinq indoles ont montré une activité nématicide significative ; la survie du groupe témoin non traité était de 95 ± 7 % après 24 h. Sur les 34 indoles testés, le 5-iodoindole et le 4-fluoroindole à 1 mM ont causé une mortalité de 100 %, tandis que le 5,6-difluoroindigo, le méthylindole-7-carboxylate et le 7-iodoindole ont causé une mortalité d'environ 50 % (tableau 1).
Effet du 5-iodoindole sur la formation de vacuoles et le métabolisme du nématode du pin. (A) Effet de l'avermectine et du 5-iodoindole sur les nématodes mâles adultes, (B) œufs de nématode au stade L1 et (C) métabolisme de B. xylophilus, (i) aucune vacuole n'a été observée à 0 h, le traitement a entraîné (ii) des vacuoles, (iii) une accumulation de vacuoles multiples, (iv) un gonflement des vacuoles, (v) une fusion des vacuoles et (vi) la formation de vacuoles géantes. Les flèches rouges indiquent le gonflement des vacuoles, les flèches bleues indiquent la fusion des vacuoles et les flèches noires indiquent les vacuoles géantes. Barre d'échelle = 50 μm.
Français De plus, cette étude a également décrit le processus séquentiel de mort induite par le méthane chez les nématodes du pin (Figure 4C). La mort méthanogène est un type de mort cellulaire non apoptotique associé à l'accumulation de vacuoles cytoplasmiques proéminentes27. Les défauts morphologiques observés chez les nématodes du pin semblent être étroitement liés au mécanisme de mort induite par le méthane. Un examen microscopique à différents moments a montré que des vacuoles géantes se formaient après 20 h d'exposition au 5-iodoindole (0,1 mM). Des vacuoles microscopiques ont été observées après 8 h de traitement et leur nombre a augmenté après 12 h. Plusieurs grandes vacuoles ont été observées après 14 h. Plusieurs vacuoles fusionnées étaient clairement visibles après 12 à 16 h de traitement, indiquant que la fusion des vacuoles est la base du mécanisme de mort méthanogène. Après 20 heures, plusieurs vacuoles géantes ont été trouvées dans tout le ver. Ces observations représentent le premier signalement de métuose chez C. elegans.
Chez les vers traités au 5-iodoindole, une agrégation et une rupture des vacuoles ont également été observées (Fig. 5), comme en témoignent la courbure des vers et la libération des vacuoles dans l'environnement. Une rupture des vacuoles a également été observée dans la membrane de la coquille de l'œuf, normalement préservée intacte par L2 lors de l'éclosion (Fig. S2 supplémentaire). Ces observations étayent l'hypothèse d'une accumulation de liquide et d'une défaillance osmorégulatrice, ainsi que d'une lésion cellulaire réversible (RCI), dans le processus de formation et de suppuration des vacuoles (Fig. 5).
Français En émettant l'hypothèse du rôle de l'iode dans la formation de vacuoles observée, nous avons étudié l'activité nématicide de l'iodure de sodium (NaI) et de l'iodure de potassium (KI). Cependant, à des concentrations (0,1, 0,5 ou 1 mM), ils n'ont eu d'effet ni sur la survie des nématodes ni sur la formation de vacuoles (Fig. supplémentaire S5), bien que 1 mM de KI ait eu un léger effet nématicide. D'autre part, le 7-iodoindole (1 ou 2 mM), comme le 5-iodoindole, a induit de multiples vacuoles et des déformations structurelles (Fig. supplémentaire S6). Les deux iodoindoles ont montré des caractéristiques phénotypiques similaires chez les nématodes du pin, contrairement à NaI et KI. Il est intéressant de noter que l'indole n'a pas induit de formation de vacuoles chez B. xylophilus aux concentrations testées (données non présentées). Ainsi, les résultats ont confirmé que le complexe indole-iode est responsable de la vacuolisation et du métabolisme de B. xylophilus.
Français Parmi les indoles testés pour l'activité nématicide, le 5-iodoindole avait l'indice de glissement le plus élevé de -5,89 kcal/mol, suivi du 7-iodoindole (-4,48 kcal/mol), du 4-fluoroindole (-4,33) et de l'indole (-4,03) ( Figure 6 ). La forte liaison hydrogène du squelette du 5-iodoindole à la leucine 218 stabilise sa liaison, tandis que tous les autres dérivés de l'indole se lient à la sérine 260 via des liaisons hydrogène de la chaîne latérale. Parmi les autres iodoindoles modélisés, le 2-iodoindole a une valeur de liaison de -5,248 kcal/mol, ce qui est dû à sa liaison hydrogène principale avec la leucine 218. D'autres liaisons connues incluent le 3-iodoindole (-4,3 kcal/mol), le 4-iodoindole (-4,0 kcal/mol) et le 6-fluoroindole (-2,6 kcal/mol) (Figure supplémentaire S8). Français La plupart des indoles halogénés et l'indole lui-même, à l'exception du 5-iodoindole et du 2-iodoindole, forment une liaison avec la sérine 260. Le fait que la liaison hydrogène avec la leucine 218 indique une liaison récepteur-ligand efficace, comme observé pour l'ivermectine (Fig. supplémentaire S7), confirme que le 5-iodoindole et le 2-iodoindole, comme l'ivermectine, se lient étroitement au site actif du récepteur GluCL via la leucine 218 (Fig. 6 et Fig. supplémentaire S8). Nous proposons que cette liaison est nécessaire au maintien de la structure à pores ouverts du complexe GluCL et qu'en se liant étroitement au site actif du récepteur GluCL, le 5-iodoindole, le 2-iodoindole, l'avermectine et l'ivermectine maintiennent ainsi le canal ionique ouvert et permettent l'absorption des fluides.
Amarrage moléculaire de l'indole et de l'indole halogéné à GluCL. Orientations de liaison des ligands (A) indole, (B) 4-fluoroindole, (C) 7-iodoindole et (D) 5-iodoindole au site actif de GluCL. La protéine est représentée par un ruban et les liaisons hydrogène du squelette sont représentées par des lignes pointillées jaunes. (A′), (B′), (C′) et (D′) montrent les interactions des ligands correspondants avec les résidus d'acides aminés environnants, et les liaisons hydrogène des chaînes latérales sont indiquées par des flèches pointillées roses.
Des expériences ont été menées pour évaluer l'effet toxique du 5-iodoindole sur la germination des graines de chou et de radis. Le 5-iodoindole (0,05 ou 0,1 mM) ou l'avermectine (10 μg/mL) ont eu peu ou pas d'effet sur la germination initiale et l'émergence des plantules (Figure 7). De plus, aucune différence significative n'a été constatée entre le taux de germination des témoins non traités et des graines traitées au 5-iodoindole ou à l'avermectine. L'effet sur l'élongation des racines pivotantes et le nombre de racines latérales formées était insignifiant, bien que 1 mM (10 fois sa concentration active) de 5-iodoindole ait légèrement retardé le développement des racines latérales. Ces résultats indiquent que le 5-iodoindole n'est pas toxique pour les cellules végétales et n'interfère pas avec les processus de développement des plantes aux concentrations étudiées.
Effet du 5-iodoindole sur la germination des graines. Germination, bourgeonnement et enracinement latéral des graines de B. oleracea et R. raphanistrum sur milieu gélosé de Murashige et Skoog avec ou sans avermectine ou 5-iodoindole. La germination a été enregistrée après 3 jours d'incubation à 22 °C.
Cette étude rapporte plusieurs cas de destruction de nématodes par des indoles. Il est important de noter qu'il s'agit du premier cas signalé d'iodoindole induisant une méthylation (processus causé par l'accumulation de petites vacuoles qui fusionnent progressivement en vacuoles géantes, entraînant finalement la rupture de la membrane et la mort) dans les aiguilles de pin. L'iodoindole présente des propriétés nématicides significatives, similaires à celles de l'avermectine, un nématicide commercial.
Il a été précédemment rapporté que les indoles exercent de multiples fonctions de signalisation chez les procaryotes et les eucaryotes, notamment l'inhibition/la formation de biofilms, la survie bactérienne et la pathogénicité19,32,33,34. Récemment, les effets thérapeutiques potentiels des indoles halogénés, des alcaloïdes indoliques et des dérivés semi-synthétiques de l'indole ont suscité un vif intérêt de la part des chercheurs35,36,37. Par exemple, il a été démontré que les indoles halogénés tuent les cellules persistantes d'Escherichia coli et de Staphylococcus aureus37. De plus, il est scientifiquement intéressant d'étudier l'efficacité des indoles halogénés contre d'autres espèces, genres et règnes, et cette étude constitue une étape vers la réalisation de cet objectif.
Français Ici, nous proposons un mécanisme de létalité induite par le 5-iodoindole chez C. elegans basé sur des lésions cellulaires réversibles (RCI) et une méthylation (Figures 4C et 5). Les changements œdémateux tels que les gonflements et la dégénérescence vacuolaire sont des indicateurs de RCI et de méthylation, se manifestant par des vacuoles géantes dans le cytoplasme48,49. Le RCI interfère avec la production d'énergie en réduisant la production d'ATP, provoquant une défaillance de la pompe ATPase ou en perturbant les membranes cellulaires et en provoquant un afflux rapide de Na+, Ca2+ et d'eau50,51,52. Les vacuoles intracytoplasmiques apparaissent dans les cellules animales à la suite de l'accumulation de liquide dans le cytoplasme due à l'afflux de Ca2+ et d'eau53. Il est intéressant de noter que ce mécanisme de dommages cellulaires est réversible si les dommages sont temporaires et que les cellules commencent à produire de l’ATP pendant une certaine période de temps, mais si les dommages persistent ou s’aggravent, les cellules meurent.54 Nos observations montrent que les nématodes traités avec du 5-iodoindole sont incapables de restaurer une biosynthèse normale après une exposition à des conditions de stress.
Français Le phénotype de méthylation induit par le 5-iodoindole chez B. xylophilus pourrait être dû à la présence d'iode et à sa distribution moléculaire, puisque le 7-iodoindole avait moins d'effet inhibiteur sur B. xylophilus que le 5-iodoindole (Tableau 1 et Figure supplémentaire S6). Ces résultats sont partiellement cohérents avec les études de Maltese et al. (2014), qui ont rapporté que la translocation de la fraction azotée pyridyle dans l'indole de la position para à la position méta abolissait la vacuolisation, l'inhibition de la croissance et la cytotoxicité dans les cellules U251, suggérant que l'interaction de la molécule avec un site actif spécifique dans la protéine est critique27,44,45. Les interactions entre l'indole ou les indoles halogénés et les récepteurs GluCL observées dans cette étude corroborent également cette hypothèse, car le 5- et le 2-iodoindole se lient aux récepteurs GluCL plus fortement que les autres indoles examinés (Figure 6 et Figure supplémentaire S8). L'iode en deuxième ou cinquième position de l'indole se lie à la leucine 218 du récepteur GluCL via des liaisons hydrogène du squelette, tandis que d'autres indoles halogénés et l'indole lui-même forment de faibles liaisons hydrogène latérales avec la sérine 260 (Figure 6). Nous supposons donc que la localisation de l'halogène joue un rôle important dans l'induction de la dégénérescence vacuolaire, tandis que la liaison étroite du 5-iodoindole maintient le canal ionique ouvert, permettant ainsi un afflux rapide de fluide et la rupture de la vacuole. Cependant, le mécanisme d'action détaillé du 5-iodoindole reste à déterminer.
Avant toute application pratique du 5-iodoindole, son effet toxique sur les plantes doit être analysé. Nos expériences de germination des graines ont montré que le 5-iodoindole n'avait aucun effet négatif sur la germination des graines ni sur les processus de développement ultérieurs aux concentrations étudiées (figure 7). Cette étude fournit donc une base pour l'utilisation du 5-iodoindole en milieu écologique afin de contrôler la nocivité des nématodes du pin pour les pins.
Des rapports antérieurs ont démontré que la thérapie à base d'indole représente une approche potentielle pour résoudre le problème de la résistance aux antibiotiques et de la progression du cancer55. De plus, les indoles possèdent des activités antibactériennes, anticancéreuses, antioxydantes, anti-inflammatoires, antidiabétiques, antivirales, antiprolifératives et antituberculeuses et pourraient servir de base prometteuse au développement de médicaments56,57. Cette étude suggère pour la première fois l'utilisation potentielle de l'iode comme agent antiparasitaire et anthelminthique.
L'avermectine a été découverte il y a trente ans et a remporté le prix Nobel en 2015. Son utilisation comme anthelminthique est toujours d'actualité. Cependant, face au développement rapide de la résistance aux avermectines chez les nématodes et les insectes nuisibles, une stratégie alternative, peu coûteuse et respectueuse de l'environnement est nécessaire pour lutter contre l'infection par le nématode du pin chez les pins. Cette étude décrit également le mécanisme par lequel le 5-iodoindole tue les nématodes du pin et révèle sa faible toxicité pour les cellules végétales, ce qui ouvre de belles perspectives pour son application commerciale future.
Toutes les expériences ont été approuvées par le Comité d'éthique de l'Université Yeungnam, Gyeongsan, Corée, et les méthodes ont été réalisées conformément aux directives du Comité d'éthique de l'Université Yeungnam.
Des expériences d'incubation d'œufs ont été réalisées selon des procédures établies43. Pour évaluer les taux d'éclosion (TE), des nématodes adultes âgés d'un jour (environ 100 femelles et 100 mâles) ont été transférés dans des boîtes de Petri contenant le champignon et laissés à se développer pendant 24 h. Les œufs ont ensuite été isolés et traités avec du 5-iodoindole (0,05 mM et 0,1 mM) ou de l'avermectine (10 μg/ml) en suspension dans de l'eau distillée stérile. Ces suspensions (500 μl ; environ 100 œufs) ont été transférées dans les puits d'une plaque de culture tissulaire à 24 puits et incubées à 22 °C. Des comptages de cellules L2 ont été effectués après 24 h d'incubation, mais étaient considérés comme morts si les cellules ne bougeaient pas lorsqu'elles étaient stimulées avec un fil de platine fin. Cette expérience a été menée en deux étapes, chacune comportant six répétitions. Les données des deux expériences ont été combinées et présentées. Le pourcentage de TE est calculé comme suit :
La mortalité larvaire a été évaluée à l'aide de procédures précédemment développées. Les œufs de nématodes ont été collectés et les embryons ont été synchronisés par éclosion dans de l'eau distillée stérile pour générer des larves de stade L2. Les larves synchronisées (environ 500 nématodes) ont été traitées avec du 5-iodoindole (0,05 mM et 0,1 mM) ou de l'avermectine (10 μg/ml) et élevées sur des boîtes de Petri contenant B. cinerea. Après 48 h d'incubation à 22 °C, les nématodes ont été collectés dans de l'eau distillée stérile et examinés pour détecter la présence des stades L2, L3 et L4. La présence des stades L3 et L4 indiquait une transformation larvaire, tandis que la présence du stade L2 n'indiquait aucune transformation. Les images ont été acquises à l'aide du système d'imagerie cellulaire numérique iRiS™. Cette expérience a été menée en deux étapes, chacune comportant six répétitions. Les données des deux expériences ont été combinées et présentées.
Français La toxicité du 5-iodoindole et de l'avermectine pour les graines a été évaluée à l'aide de tests de germination sur des plaques de gélose de Murashige et Skoog.62 graines de B. oleracea et de R. raphanistrum ont d'abord été trempées dans de l'eau distillée stérile pendant une journée, lavées avec 1 ml d'éthanol à 100 %, stérilisées avec 1 ml d'eau de Javel commerciale à 50 % (hypochlorite de sodium à 3 %) pendant 15 minutes, et lavées cinq fois avec 1 ml d'eau stérile. Les graines stérilisées ont ensuite été pressées sur des plaques de gélose de germination contenant 0,86 g/l (0,2X) de milieu de Murashige et Skoog et 0,7 % de gélose bactériologique avec ou sans 5-iodoindole ou avermectine. Les plaques ont ensuite été incubées à 22 °C, et des images ont été prises après 3 jours d'incubation. Cette expérience a été menée en deux étapes, chacune comportant six répétitions.
Date de publication : 26 février 2025