Le nématode du pin est un endoparasite migrateur soumis à quarantaine, connu pour causer d'importantes pertes économiques dans les écosystèmes forestiers de pins. La présente étude examine l'activité nématicide des indoles halogénés contre le nématode du pin et leur mécanisme d'action. Les activités nématicides du 5-iodoindole et de l'avermectine (témoin positif) contre le nématode du pin étaient similaires et élevées à de faibles concentrations (10 μg/mL). Le 5-iodoindole a réduit la fécondité, l'activité reproductive, la mortalité embryonnaire et larvaire, ainsi que le comportement locomoteur. Les interactions moléculaires des ligands avec les récepteurs des canaux chlorure glutamate-dépendants spécifiques aux invertébrés confirment l'hypothèse selon laquelle le 5-iodoindole, comme l'avermectine, se lie fortement au site actif du récepteur. Le 5-iodoindole a également induit diverses déformations phénotypiques chez les nématodes, notamment un affaissement/rétrécissement anormal des organes et une vacuolisation accrue. Ces résultats suggèrent que les vacuoles pourraient jouer un rôle dans la mort des nématodes induite par la méthylation. Il est important de noter que le 5-iodoindole s'est avéré non toxique pour les deux espèces végétales (chou et radis). Ainsi, cette étude démontre que l'application d'iodoindole dans des conditions environnementales appropriées peut limiter les dégâts causés par le flétrissement du pin.
Le nématode du pin (Bursaphelenchus xylophilus) appartient à la famille des nématodes du pin (NP), des nématodes endoparasites migrateurs connus pour causer de graves dommages écologiques aux écosystèmes forestiers de pins¹. Le dépérissement du pin (DP), causé par ce nématode, devient un problème majeur sur plusieurs continents, notamment en Asie et en Europe. En Amérique du Nord, le nématode décime les espèces de pins introduites¹,². Le dépérissement des pins représente un problème économique important et la perspective de sa propagation mondiale est préoccupante³. Les espèces de pins les plus fréquemment attaquées par ce nématode sont : Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis et Pinus radiata⁴. Le nématode du pin est une maladie grave qui peut tuer les pins en quelques semaines ou quelques mois après l’infection. De plus, les épidémies de nématodes du pin sont fréquentes dans divers écosystèmes, de sorte que des chaînes d’infection persistantes ont été établies1.
Bursaphelenchus xylophilus est un nématode phytoparasite soumis à quarantaine, appartenant à la superfamille des Aphelenchoidea et au clade 102.5. Ce nématode se nourrit de champignons et se reproduit dans le bois des pins, en se développant en quatre stades larvaires : L1, L2, L3, L4 et un individu adulte1,6. En cas de pénurie alimentaire, le nématode du pin passe à un stade larvaire spécialisé, le dauer, qui parasite son vecteur, le scolyte du pin (Monochamus alternatus), et est transmis à des pins sains. Chez les hôtes sains, les nématodes migrent rapidement à travers les tissus végétaux et se nourrissent des cellules parenchymateuses, ce qui provoque diverses réactions d’hypersensibilité, le flétrissement du pin et sa mort dans l’année suivant l’infection1,7,8.
La lutte biologique contre les nématodes du pin représente un défi de longue date, les mesures de quarantaine remontant au XXe siècle. Les stratégies actuelles de lutte contre ces nématodes reposent principalement sur des traitements chimiques, notamment la fumigation du bois et l'implantation de nématicides dans les troncs. Les nématicides les plus couramment utilisés sont l'avermectine et le benzoate d'avermectine, appartenant à la famille des avermectines. Ces produits chimiques, coûteux, sont très efficaces contre de nombreuses espèces de nématodes et sont considérés comme sans danger pour l'environnement9. Cependant, leur utilisation répétée devrait engendrer une pression de sélection qui conduira presque certainement à l'émergence de nématodes du pin résistants, comme cela a été démontré pour plusieurs insectes ravageurs, tels que Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella et les nématodes Trichostrongylus colubriformis et Ostertagia circumcincta, qui ont progressivement développé une résistance aux avermectines10,11,12. Par conséquent, il est nécessaire d'étudier régulièrement les profils de résistance et de procéder à un criblage continu des nématicides afin de trouver des solutions alternatives, économiques et respectueuses de l'environnement pour lutter contre la maladie du poirier. Ces dernières décennies, plusieurs auteurs ont proposé l'utilisation d'extraits de plantes, d'huiles essentielles et de composés volatils comme agents de lutte contre les nématodes13,14,15,16.
Nous avons récemment démontré l'activité nématicide de l'indole, une molécule de signalisation intercellulaire et inter-règnes, chez Caenorhabditis elegans17. L'indole est un signal intracellulaire répandu en écologie microbienne, contrôlant de nombreuses fonctions qui affectent la physiologie microbienne, la sporulation, la stabilité des plasmides, la résistance aux médicaments, la formation de biofilms et la virulence18,19. L'activité de l'indole et de ses dérivés contre d'autres nématodes pathogènes n'a pas encore été étudiée. Dans cette étude, nous avons examiné l'activité nématicide de 34 indoles contre les nématodes du pin et élucidé le mécanisme d'action du plus puissant, le 5-iodoindole, par microscopie, photographie en temps réel et modélisation moléculaire. Nous avons également évalué sa toxicité sur les plantes par un test de germination des semences.
Il a été précédemment rapporté que des concentrations élevées d'indole (>1,0 mM) exercent un effet nématicide sur les nématodes17. Après traitement de B. xylophilus (à différents stades de développement) avec de l'indole ou 33 dérivés différents de l'indole à 1 mM, la mortalité de B. xylophilus a été mesurée par comptage des nématodes vivants et morts dans les groupes témoins et traités. Cinq indoles ont présenté une activité nématicide significative ; la survie du groupe témoin non traité était de 95 ± 7 % après 24 h. Parmi les 34 indoles testés, le 5-iodoindole et le 4-fluoroindole à 1 mM ont induit une mortalité de 100 %, tandis que le 5,6-difluoroindigo, le méthylindole-7-carboxylate et le 7-iodoindole ont induit une mortalité d'environ 50 % (tableau 1).
Effet du 5-iodoindole sur la formation des vacuoles et le métabolisme du nématode du pin. (A) Effet de l'avermectine et du 5-iodoindole sur les nématodes mâles adultes, (B) œufs de nématodes au stade L1 et (C) métabolisme de B. xylophilus. (i) Aucune vacuole n'a été observée à t = 0 h. Le traitement a entraîné (ii) l'apparition de vacuoles, (iii) l'accumulation de plusieurs vacuoles, (iv) le gonflement des vacuoles, (v) la fusion des vacuoles et (vi) la formation de vacuoles géantes. Les flèches rouges indiquent le gonflement des vacuoles, les flèches bleues la fusion des vacuoles et les flèches noires les vacuoles géantes. Échelle : 50 µm.
De plus, cette étude décrit le processus séquentiel de la mort induite par le méthane chez les nématodes du pin (Figure 4C). La mort méthanogène est un type de mort cellulaire non apoptotique associé à l'accumulation de vacuoles cytoplasmiques proéminentes27. Les anomalies morphologiques observées chez les nématodes du pin semblent étroitement liées au mécanisme de la mort induite par le méthane. L'examen microscopique à différents moments a montré la formation de vacuoles géantes après 20 h d'exposition au 5-iodoindole (0,1 mM). Des vacuoles microscopiques ont été observées après 8 h de traitement, et leur nombre a augmenté après 12 h. Plusieurs grandes vacuoles ont été observées après 14 h. Plusieurs vacuoles fusionnées étaient clairement visibles après 12 à 16 h de traitement, indiquant que la fusion des vacuoles est à la base du mécanisme de la mort méthanogène. Après 20 heures, plusieurs vacuoles géantes ont été trouvées dans tout le ver. Ces observations constituent le premier rapport de métuose chez C. elegans.
Chez les vers traités au 5-iodoindole, une agrégation et une rupture des vacuoles ont également été observées (Fig. 5), comme en témoignent la courbure des vers et la libération des vacuoles dans le milieu. Une rupture des vacuoles a aussi été observée dans la membrane de la coquille d'œuf, normalement préservée intacte par les larves L2 lors de l'éclosion (Fig. S2 supplémentaire). Ces observations suggèrent l'implication de l'accumulation de fluides et d'un dysfonctionnement osmorégulateur, ainsi que d'une lésion cellulaire réversible (LCR), dans le processus de formation et de suppuration des vacuoles (Fig. 5).
Partant de l'hypothèse d'un rôle de l'iode dans la formation de vacuoles observée, nous avons étudié l'activité nématicide de l'iodure de sodium (NaI) et de l'iodure de potassium (KI). Cependant, aux concentrations testées (0,1, 0,5 ou 1 mM), ces composés n'ont affecté ni la survie des nématodes ni la formation de vacuoles (Fig. S5, données supplémentaires), bien que KI à 1 mM ait présenté un léger effet nématicide. En revanche, le 7-iodoindole (1 ou 2 mM), tout comme le 5-iodoindole, a induit la formation de vacuoles multiples et des déformations structurales (Fig. S6, données supplémentaires). Les deux iodoindoles ont présenté des caractéristiques phénotypiques similaires chez les nématodes du pin, contrairement à NaI et KI. Il est intéressant de noter que l'indole n'a pas induit la formation de vacuoles chez B. xylophilus aux concentrations testées (données non présentées). Ainsi, les résultats ont confirmé que le complexe indole-iode est responsable de la vacuolisation et du métabolisme de B. xylophilus.
Parmi les indoles testés pour leur activité nématicide, le 5-iodoindole présentait l'indice de glissement le plus élevé (-5,89 kcal/mol), suivi du 7-iodoindole (-4,48 kcal/mol), du 4-fluoroindole (-4,33) et de l'indole (-4,03) (Figure 6). La forte liaison hydrogène du squelette peptidique du 5-iodoindole à la leucine 218 stabilise sa fixation, tandis que tous les autres dérivés de l'indole se lient à la sérine 260 par des liaisons hydrogène de leurs chaînes latérales. Parmi les autres iodoindoles modélisés, le 2-iodoindole a une valeur de liaison de -5,248 kcal/mol, due à sa liaison hydrogène principale avec la leucine 218. D'autres liaisons connues incluent le 3-iodoindole (-4,3 kcal/mol), le 4-iodoindole (-4,0 kcal/mol) et le 6-fluoroindole (-2,6 kcal/mol) (Figure supplémentaire S8). La plupart des indoles halogénés et l'indole lui-même, à l'exception du 5-iodoindole et du 2-iodoindole, forment une liaison avec la sérine 260. Le fait que la formation de liaisons hydrogène avec la leucine 218 soit un indicateur d'une interaction efficace entre le récepteur et le ligand, comme observé pour l'ivermectine (Fig. S7 supplémentaire), confirme que le 5-iodoindole et le 2-iodoindole, à l'instar de l'ivermectine, se lient fortement au site actif du récepteur GluCL via la leucine 218 (Fig. 6 et Fig. S8 supplémentaire). Nous proposons que cette liaison soit nécessaire au maintien de la structure à pores ouverts du complexe GluCL et que, par leur forte affinité pour le site actif du récepteur GluCL, le 5-iodoindole, le 2-iodoindole, l'ivermectine et l'ivermectine maintiennent ainsi le canal ionique ouvert et permettent l'absorption de fluide.
Modélisation moléculaire de l'indole et de l'indole halogéné sur la GluCL. Orientations de liaison des ligands (A) indole, (B) 4-fluoroindole, (C) 7-iodoindole et (D) 5-iodoindole au site actif de la GluCL. La protéine est représentée par un ruban et les liaisons hydrogène du squelette peptidique par des pointillés jaunes. (A′), (B′), (C′) et (D′) illustrent les interactions des ligands correspondants avec les résidus d'acides aminés environnants, et les liaisons hydrogène des chaînes latérales sont indiquées par des flèches pointillées roses.
Des expériences ont été menées pour évaluer la toxicité du 5-iodoindole sur la germination des graines de chou et de radis. Le 5-iodoindole (0,05 ou 0,1 mM) et l'avermectine (10 μg/mL) n'ont eu que peu ou pas d'effet sur la germination initiale et l'émergence des plantules (Figure 7). De plus, aucune différence significative n'a été observée entre le taux de germination des témoins non traités et celui des graines traitées au 5-iodoindole ou à l'avermectine. L'effet sur l'élongation de la racine pivotante et le nombre de racines latérales formées était négligeable, bien qu'une concentration de 1 mM (10 fois sa concentration active) de 5-iodoindole ait légèrement retardé le développement des racines latérales. Ces résultats indiquent que le 5-iodoindole est non toxique pour les cellules végétales et n'interfère pas avec le développement des plantes aux concentrations étudiées.
Effet du 5-iodoindole sur la germination des graines. Germination, levée et enracinement latéral des graines de B. oleracea et de R. raphanistrum sur milieu gélosé de Murashige et Skoog, avec ou sans avermectine ou 5-iodoindole. La germination a été enregistrée après 3 jours d'incubation à 22 °C.
Cette étude rapporte plusieurs cas de mortalité des nématodes induite par les indoles. Fait important, il s'agit du premier rapport faisant état de l'induction de la méthylation par l'iodoindole (un processus causé par l'accumulation de petites vacuoles qui fusionnent progressivement en vacuoles géantes, entraînant finalement la rupture de la membrane et la mort) dans les aiguilles de pin. L'iodoindole présente des propriétés nématicides significatives, similaires à celles de l'avermectine, un nématicide commercial.
Il a été précédemment démontré que les indoles exercent de multiples fonctions de signalisation chez les procaryotes et les eucaryotes, notamment l'inhibition/la formation de biofilms, la survie bactérienne et la pathogénicité19,32,33,34. Récemment, les effets thérapeutiques potentiels des indoles halogénés, des alcaloïdes indoliques et des dérivés semi-synthétiques de l'indole ont suscité un vif intérêt de la recherche35,36,37. Par exemple, il a été montré que les indoles halogénés sont capables d'éliminer les cellules persistantes d'Escherichia coli et de Staphylococcus aureus37. De plus, il est scientifiquement pertinent d'étudier l'efficacité des indoles halogénés contre d'autres espèces, genres et règnes, et cette étude constitue un pas en avant vers cet objectif.
Nous proposons ici un mécanisme de létalité induite par le 5-iodoindole chez C. elegans, basé sur une lésion cellulaire réversible (LCR) et la méthylation (figures 4C et 5). Les modifications œdémateuses, telles que le gonflement et la dégénérescence vacuolaire, sont des indicateurs de LCR et de méthylation, se manifestant par des vacuoles géantes dans le cytoplasme48,49. La LCR perturbe la production d'énergie en réduisant la production d'ATP, en provoquant une défaillance de la pompe ATPase, ou en altérant les membranes cellulaires et en induisant un afflux rapide de Na+, Ca2+ et d'eau50,51,52. Les vacuoles intracytoplasmiques apparaissent dans les cellules animales suite à une accumulation de liquide dans le cytoplasme due à l'afflux de Ca2+ et d'eau53. Il est intéressant de noter que ce mécanisme de lésion cellulaire est réversible si la lésion est temporaire et que les cellules commencent à produire de l'ATP pendant une certaine période, mais si la lésion persiste ou s'aggrave, les cellules meurent.54 Nos observations montrent que les nématodes traités au 5-iodoindole sont incapables de rétablir une biosynthèse normale après une exposition à des conditions de stress.
Le phénotype de méthylation induit par le 5-iodoindole chez B. xylophilus pourrait être dû à la présence d'iode et à sa distribution moléculaire, puisque le 7-iodoindole a un effet inhibiteur moindre sur B. xylophilus que le 5-iodoindole (Tableau 1 et Figure supplémentaire S6). Ces résultats concordent partiellement avec les études de Maltese et al. (2014), qui ont montré que la translocation du groupement azoté pyridyle de l'indole de la position para à la position méta abolit la vacuolisation, l'inhibition de la croissance et la cytotoxicité dans les cellules U251, suggérant que l'interaction de la molécule avec un site actif spécifique de la protéine est cruciale27,44,45. Les interactions observées dans cette étude entre l'indole ou les indoles halogénés et les récepteurs GluCL corroborent cette hypothèse. En effet, le 5-iodoindole et le 2-iodoindole se lient aux récepteurs GluCL avec une affinité supérieure à celle des autres indoles étudiés (Figure 6 et Figure supplémentaire S8). L'iode en position 2 ou 5 de l'indole se lie à la leucine 218 du récepteur GluCL par des liaisons hydrogène impliquant le squelette peptidique, tandis que les autres indoles halogénés et l'indole lui-même forment des liaisons hydrogène faibles avec la sérine 260 via leurs chaînes latérales (Figure 6). Nous supposons donc que la localisation de l'halogène joue un rôle important dans l'induction de la dégénérescence vacuolaire, tandis que la forte affinité du 5-iodoindole maintient le canal ionique ouvert, permettant ainsi un afflux rapide de fluide et la rupture de la vacuole. Cependant, le mécanisme d'action précis du 5-iodoindole reste à élucider.
Avant toute application pratique du 5-iodoindole, il convient d'analyser sa toxicité sur les plantes. Nos expériences de germination ont montré que, aux concentrations étudiées (Figure 7), le 5-iodoindole n'avait aucun effet négatif sur la germination ni sur le développement ultérieur des graines. Cette étude justifie donc l'utilisation du 5-iodoindole en milieu naturel pour lutter contre les ravageurs causés par les nématodes du pin.
Des études antérieures ont démontré que les thérapies à base d'indoles constituent une approche potentielle pour lutter contre la résistance aux antibiotiques et la progression du cancer55. De plus, les indoles possèdent des propriétés antibactériennes, anticancéreuses, antioxydantes, anti-inflammatoires, antidiabétiques, antivirales, antiprolifératives et antituberculeuses, et pourraient représenter une base prometteuse pour le développement de médicaments56,57. Cette étude suggère pour la première fois l'utilisation potentielle de l'iode comme agent antiparasitaire et anthelminthique.
Découverte il y a trente ans et récompensée par le prix Nobel en 2015, l'avermectine est toujours utilisée comme anthelminthique. Cependant, face au développement rapide de résistances aux avermectines chez les nématodes et les insectes ravageurs, une stratégie alternative, économique et respectueuse de l'environnement est nécessaire pour lutter contre l'infestation par le nématode du pin (PWN) dans les pins. Cette étude décrit également le mécanisme d'action du 5-iodoindole sur les nématodes du pin et démontre sa faible toxicité pour les cellules végétales, ce qui ouvre des perspectives prometteuses pour son application commerciale future.
Toutes les expériences ont été approuvées par le Comité d'éthique de l'Université de Yeungnam, Gyeongsan, Corée, et les méthodes ont été réalisées conformément aux directives du Comité d'éthique de l'Université de Yeungnam.
Des expériences d'incubation d'œufs ont été réalisées selon des procédures établies43. Pour évaluer les taux d'éclosion (TE), des nématodes adultes âgés d'un jour (environ 100 femelles et 100 mâles) ont été transférés dans des boîtes de Petri contenant le champignon et mis en culture pendant 24 h. Les œufs ont ensuite été isolés et traités avec du 5-iodoindole (0,05 mM et 0,1 mM) ou de l'avermectine (10 μg/ml) en suspension dans de l'eau distillée stérile. Ces suspensions (500 μl ; environ 100 œufs) ont été transférées dans les puits d'une plaque de culture cellulaire à 24 puits et incubées à 22 °C. Le nombre de larves L2 a été déterminé après 24 h d'incubation, mais les cellules ont été considérées comme mortes si elles ne bougeaient pas lorsqu'elles étaient stimulées par un fin fil de platine. Cette expérience a été menée en deux étapes, chacune comportant six répétitions. Les données des deux expériences ont été combinées et présentées. Le pourcentage de TE est calculé comme suit :
La mortalité larvaire a été évaluée selon des procédures précédemment établies. Les œufs de nématodes ont été collectés et les embryons synchronisés par éclosion dans de l'eau distillée stérile afin d'obtenir des larves au stade L2. Les larves synchronisées (environ 500 nématodes) ont été traitées avec du 5-iodoindole (0,05 mM et 0,1 mM) ou de l'avermectine (10 μg/ml) et élevées sur des boîtes de Petri contenant du B. cinerea. Après 48 h d'incubation à 22 °C, les nématodes ont été collectés dans de l'eau distillée stérile et examinés afin de déterminer la présence des stades L2, L3 et L4. La présence des stades L3 et L4 indiquait la transformation larvaire, tandis que la présence du stade L2 indiquait l'absence de transformation. Les images ont été acquises à l'aide du système d'imagerie cellulaire numérique iRiS™. Cette expérience a été menée en deux étapes, chacune comportant six répétitions. Les données des deux expériences ont été combinées et présentées.
La toxicité du 5-iodoindole et de l'avermectine sur les semences a été évaluée par des tests de germination sur gélose Murashige-Skoog.⁶² Les semences de *Brassica oleracea* et de *Rosa raphanistrum* ont d'abord été trempées dans de l'eau distillée stérile pendant 24 heures, lavées avec 1 ml d'éthanol à 100 %, stérilisées avec 1 ml d'eau de Javel commerciale à 50 % (hypochlorite de sodium à 3 %) pendant 15 minutes, puis rincées cinq fois avec 1 ml d'eau stérile. Les semences stérilisées ont ensuite été pressées sur des plaques de gélose de germination contenant 0,86 g/l (0,2X) de milieu Murashige-Skoog et 0,7 % d'agar bactériologique, avec ou sans 5-iodoindole ou avermectine. Les plaques ont ensuite été incubées à 22 °C et des images ont été prises après 3 jours d'incubation. Cette expérience a été menée en deux étapes, chacune comportant six répétitions.
Date de publication : 26 février 2025