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La découverte et l'utilisation bénéfique de produits naturels peuvent contribuer à améliorer la vie humaine. Les inhibiteurs de croissance des plantes sont largement utilisés comme herbicides pour lutter contre les mauvaises herbes. Face à la nécessité d'utiliser différents types d'herbicides, il est nécessaire d'identifier des composés dotés de nouveaux mécanismes d'action. Dans cette étude, nous avons découvert un nouveau composé N-alcoxypyrrole, le coumamonamide, issu de Streptomyces werraensis MK493-CF1, et établi son processus de synthèse complet. Grâce à des tests d'activité biologique, nous avons découvert que l'acide urs-monoamique est un intermédiaire synthétique de l'urs-monoamide et un potentiel potentiel.inhibiteur de croissance des plantesDe plus, nous avons développé divers dérivés de l'acide urbénonique, dont le dérivé urbényloxy (UDA), qui possède une activité herbicide élevée sans affecter négativement la croissance des cellules HeLa. Nous avons également constaté que les dérivés de l'acide urmotonique perturbent les microtubules végétaux ; de plus, KAND affecte les filaments d'actine et induit la mort cellulaire ; ces effets multiformes diffèrent de ceux des inhibiteurs de microtubules connus et suggèrent un nouveau mécanisme d'action pour l'acide ursonique, ce qui représente un avantage important dans le développement de nouveaux herbicides.
La découverte et l'application pratique de produits naturels bénéfiques et de leurs dérivés contribuent à améliorer la qualité de vie humaine. Les métabolites secondaires produits par les micro-organismes, les plantes et les insectes ont permis des avancées majeures en médecine et en agriculture. De nombreux antibiotiques et médicaments antileucémiques ont été développés à partir de produits naturels. De plus, divers types depesticides, des fongicides et des herbicides sont extraits de ces produits naturels pour être utilisés en agriculture. En particulier, les herbicides anti-mauvaises herbes sont des outils importants pour augmenter les rendements des cultures dans l'agriculture moderne, et divers types de composés sont déjà utilisés commercialement. Plusieurs processus cellulaires chez les plantes, tels que la photosynthèse, le métabolisme des acides aminés, la synthèse de la paroi cellulaire, la régulation de la mitose, la signalisation des phytohormones ou la synthèse des protéines, sont considérés comme des cibles typiques des herbicides. Les composés qui inhibent la fonction des microtubules constituent une classe courante d'herbicides qui affectent la croissance des plantes en agissant sur la régulation mitotique2.
Les microtubules sont des composants du cytosquelette et sont largement conservés dans les cellules eucaryotes. L'hétérodimère de tubuline est constitué d'α-tubuline et de β-tubuline formant des protofilaments de microtubules linéaires, avec 13 protofilaments formant une structure cylindrique. Les microtubules jouent de multiples rôles dans les cellules végétales, notamment la détermination de la forme cellulaire, de la division cellulaire et du transport intracellulaire3,4. Les cellules végétales contiennent des microtubules sous la membrane plasmique en interphase, et ces microtubules dits corticaux contrôleraient l'organisation des microfibrilles de cellulose par la régulation des complexes de cellulose synthase4,5. Les microtubules corticaux des cellules épidermiques racinaires, présents dans la zone d'élongation rapide de l'extrémité racinaire, sont situés latéralement, et les microfibres de cellulose suivent ces microtubules et limitent la direction de l'expansion cellulaire, favorisant ainsi l'élongation cellulaire anisotrope. Par conséquent, la fonction des microtubules est étroitement liée à la morphologie des plantes. Les substitutions d'acides aminés dans les gènes codant la tubuline provoquent une distorsion des réseaux de microtubules corticaux et une croissance à gauche ou à droite chez Arabidopsis 6,7. De même, des mutations dans les protéines associées aux microtubules qui régulent la dynamique des microtubules peuvent également entraîner une croissance racinaire déformée 8,9,10,11,12,13. De plus, le traitement avec des herbicides perturbateurs des microtubules tels que le disopyramide, également connu sous le nom de prétilachlore, provoque également une croissance racinaire oblique à gauche 14. Ces données indiquent qu'une régulation précise de la fonction des microtubules est essentielle pour déterminer la direction de la croissance des plantes.
Différents types d'inhibiteurs de microtubules ont été découverts, et ces médicaments ont apporté des contributions significatives à la recherche sur le cytosquelette, ainsi qu'à l'agriculture et à la médecine. 2 En particulier, l'oryzaline, les composés de dinitroaniline, le disopyramide, les composés apparentés au benzamide et leurs analogues peuvent inhiber la fonction des microtubules et ainsi inhiber la croissance des plantes. De ce fait, ils sont largement utilisés comme herbicides. Cependant, les microtubules étant un composant important des cellules végétales et animales, la plupart de ces inhibiteurs sont cytotoxiques pour les deux types de cellules. Par conséquent, malgré leur utilité reconnue comme herbicides, un nombre limité d'agents antimicrotubulaires sont utilisés à des fins pratiques.
Streptomyces est un genre de la famille des Streptomyces, qui comprend des bactéries filamenteuses aérobies à Gram positif et est largement connu pour sa capacité à produire une large gamme de métabolites secondaires. Par conséquent, il est considéré comme l'une des sources les plus importantes de nouveaux produits naturels biologiquement actifs. Dans la présente étude, nous avons découvert un nouveau composé appelé coumamonamide, qui a été isolé de Streptomyces werraensis MK493-CF1 et S. werraensis ISP 5486. Par analyse spectrale et analyse spectrale complète, la structure du coumamonamide a été caractérisée et son squelette N-alcoxypyrrole unique a été déterminé. synthèse. L'acide ursmonique, un intermédiaire synthétique de l'ursmonoamide et de ses dérivés, s'est avéré inhiber la croissance et la germination de la plante modèle populaire Arabidopsis thaliana. Dans une étude de la relation structure-activité, nous avons découvert qu'un composé dont le C9 est modifié en acide ursonique, appelé dérivé nonyloxy de l'acide ursonique (KAND), renforce significativement l'effet inhibiteur sur la croissance et la germination. Il est à noter que cet inhibiteur de croissance végétale récemment découvert affecte également la croissance du tabac et de l'hépatique et n'est pas cytotoxique pour les bactéries ni pour les cellules HeLa. De plus, certains dérivés de l'acide urmotonique induisent un phénotype racinaire altéré, ce qui implique que ces dérivés affectent directement ou indirectement les microtubules. Conformément à cette idée, nos observations de microtubules marqués par immunohistochimie ou par des protéines fluorescentes indiquent que le traitement par KAND dépolymérise les microtubules. De plus, le traitement par dérivés de l'acide kumamotonique perturbe les microfilaments d'actine. Nous avons ainsi découvert un nouvel inhibiteur de croissance végétale dont le mécanisme d'action unique implique la destruction du cytosquelette.
La souche MK493-CF1 a été isolée du sol à Shinagawa-ku, Tokyo. Elle forme un mycélium stromal bien ramifié. La séquence partielle du gène de l'ARN ribosomique 16S (1422 pb) a été déterminée. Cette souche est très similaire à S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 pb, T : souche typique, 99,93 %). Ce résultat a permis de déterminer que cette souche était étroitement apparentée à la souche type de S. werraensis. Par conséquent, nous avons provisoirement nommé cette souche S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T produit également les mêmes composés bioactifs. Comme les premières recherches sur l'obtention de produits naturels à partir de ce micro-organisme étaient rares, des recherches chimiques complémentaires ont été menées. Après culture de S. werraensis MK493-CF1 sur milieu d'orge par fermentation en milieu solide à 30 °C pendant 14 jours, le milieu a été extrait avec de l'EtOH à 50 %. 60 ml d'échantillon ont été séchés pour obtenir 59,5 mg d'extrait brut. L'extrait brut a été soumis à une HPLC en phase inverse pour donner le N-méthoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, appelé coumamonamide, 36,0 mg). La quantité totale de 1 représente environ 60 % de l'extrait brut. Par conséquent, nous avons décidé d'étudier en détail les propriétés du kumamotoamide 1.
Le coumamonamide 1 est une poudre amorphe blanche et la spectrométrie de masse à haute résolution (HRESIMS) confirme C6H8N2O2 (Fig. 1). Le fragment pyrrole substitué en C2 de ce composé est caractérisé par δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH dans le spectre RMN 1H : 4,5 Hz, H-5) et δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), et le spectre RMN 13C montre la présence de quatre atomes de carbone sp2. La présence d'un groupe amide en position C2 a été évaluée par corrélation HMBC du proton C-3 au carbone carbonyle de l'amide à δC 161,1. De plus, les pics RMN du 1 H et du 13 C à δH 4,10 (3H, S) et δC 68,3 indiquent la présence de groupes N-méthoxy dans la molécule. Bien que la position correcte du groupe méthoxy n'ait pas encore été déterminée par analyse spectroscopique telle que la spectroscopie différentielle améliorée et l'abréviation nucléaire d'Overhauser (NOEDF), le N-méthoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide est devenu le premier composé candidat.
Français Pour déterminer la structure correcte de 1, une synthèse totale a été réalisée (Fig. 2a). Le traitement de la 2-aminopyridine 2 disponible dans le commerce avec du m-CPBA a donné le N-oxyde 3 correspondant avec un rendement quantitatif. Après la 2-aminoazidation de 2, la réaction de cyclocondensation décrite par Abramovich a été réalisée dans du benzène à 90 °C pour obtenir le 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 souhaité en grammes. Vitesse 60 % (deux étapes). 15,16. La méthylation et l'hydrolyse de 4 ont ensuite donné l'acide 1-méthoxy-1H-pyrrole-2-carboxylique (appelé « acide cumotonique », 6) avec un bon rendement (70 %, deux étapes). Enfin, l'amidation via l'intermédiaire chlorure d'acide 6 en utilisant de l'ammoniaque aqueuse a donné l'amide de Kumamoto 1 avec un rendement de 98 %. Toutes les données spectrales de 1 synthétisé étaient similaires à celles de 1 isolé, de sorte que la structure de 1 a été déterminée ;
Synthèse générale et analyse de l'activité biologique de l'urbénamide et de l'acide urbénique. (a) Synthèse totale de l'amide de Kumamoto. (b) Des semis d'Arabidopsis Columbia (Col) de type sauvage âgés de sept jours ont été cultivés sur des plaques de Murashige et Skoog (MS) contenant du coumamonamide 6 ou du coumamonamide 1 aux concentrations indiquées. Barre d'échelle = 1 cm.
Tout d'abord, nous avons évalué les activités biologiques de l'urbénamide et de ses intermédiaires pour leur capacité à moduler la croissance des plantes. Nous avons ajouté diverses concentrations d'ursmonamide 1 ou d'acide ursmonique 6 à un milieu gélosé MS et cultivé des plantules d'Arabidopsis thaliana sur ce milieu. Ces essais ont montré que des concentrations élevées (500 μM) de 6 inhibaient la croissance racinaire (Fig. 2b). Ensuite, nous avons généré divers dérivés en substituant la position N1 de 6 et avons réalisé des études de relation structure-activité sur ces derniers (le processus de synthèse de l'analogue est décrit dans les Informations complémentaires (SI)). Les plantules d'Arabidopsis ont été cultivées sur un milieu contenant 50 μM de dérivés d'acide ursonique, et la longueur des racines a été mesurée, comme illustré sur la photo. Comme le montrent les figures 3a, b et S1, les acides coumamo présentent des chaînes alcoxy linéaires de différentes longueurs (9, 10, 11, 12 et 13) ou de grandes chaînes alcoxy (15, 16 et 17) en position N1. Ces dérivés ont montré une inhibition significative de la croissance racinaire. De plus, nous avons constaté que l'application de 200 μM de 10, 11 ou 17 inhibait la germination (figures 3c et S2).
Étude de la relation structure-activité de l'amide de Kumamoto et de composés apparentés. (a) Structure et schéma de synthèse des analogues. (b) Quantification de la longueur des racines de plantules de 7 jours cultivées sur milieu MS avec ou sans dérivés de coumamonamide 50 μM. Les astérisques indiquent des différences significatives avec le traitement fictif (test t, p< 0,05). n>18. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart type. nt signifie « non testé » car plus de 50 % des graines n'ont pas germé. (c) Quantification du taux de germination des graines traitées et incubées pendant 7 jours dans un milieu MS avec ou sans 200 μM de coumamonamide et composés apparentés. Les astérisques indiquent les différences significatives avec le traitement fictif (test du khi carré). n = 96.
Il est intéressant de noter que l’ajout de chaînes latérales alkyles plus longues que C9 a réduit l’activité inhibitrice, suggérant que les composés apparentés à l’acide kumamotoique nécessitent des chaînes latérales d’une certaine taille pour présenter leur activité biologique.
Français Étant donné que l'analyse de la relation structure-activité a montré que C9 a été modifié en acide ursonique et que le dérivé nonyloxy de l'acide ursonique (ci-après appelé KAND 11) était l'inhibiteur de croissance des plantes le plus efficace, nous avons procédé à une caractérisation plus détaillée de KAND 11. Le traitement d'Arabidopsis avec 50 μM de KAND 11 a presque complètement empêché la germination, tandis que des concentrations plus faibles (40, 30, 20 ou 10 μM) de KAND 11 ont inhibé la croissance des racines de manière dose-dépendante (Fig. 4a, b). Pour tester si KAND 11 affecte la viabilité des méristèmes racinaires, nous avons examiné des méristèmes racinaires colorés à l'iodure de propidium (IP) et mesuré la taille de la zone méristématique. Français La taille du méristème des plantules cultivées sur un milieu contenant 25 μM de KAND-11 était de 151,1 ± 32,5 μm, tandis que la taille du méristème des plantules cultivées sur un milieu témoin contenant du DMSO était de 264,7 ± 30,8 μm (Fig. 4c, d), ce qui indique que KAND-11 restaure l'activité cellulaire. propagation. Méristème racinaire. Conformément à cela, le traitement au KAND 11 a réduit la quantité de signal du marqueur de division cellulaire CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS dans le méristème racinaire (Fig. 4e) 17 . Ces résultats indiquent que KAND 11 inhibe la croissance des racines en réduisant l'activité de prolifération cellulaire.
Analyse de l'effet inhibiteur des dérivés de l'acide urbénonique (dérivés urbényloxy) sur la croissance. (a) Plantules sauvages de Col de 7 jours cultivées sur des plaques MS avec les concentrations indiquées de KAND 11. Barre d'échelle = 1 cm. (b) Quantification de la longueur des racines. Les lettres indiquent les différences significatives (test HSD de Tukey, p< 0,05). n>16. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart type. (c) Microscopie confocale de racines de Col de type sauvage colorées à l'iodure de propidium cultivées sur des plaques MS avec ou sans 25 μM de KAND 11. Les crochets blancs indiquent le méristème racinaire. Barre d'échelle = 100 µm. (d) Quantification de la taille du méristème racinaire (n = 10 à 11). Les différences statistiques ont été déterminées à l'aide du test t (p< 0,05). Les barres représentent la taille moyenne du méristème. (e) Microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC) d'un méristème racinaire contenant la construction CDKB2 ; 1pro : CDKB2 ; 1-GUS coloré et coloré sur des semis de 5 jours cultivés sur des plaques MS avec ou sans dosage KAND 25 µM.
La phytotoxicité de KAND 11 a été testée plus en détail sur une autre plante dicotylédone, le tabac (Nicotiana tabacum), et un organisme modèle majeur de plante terrestre, l'hépatique (Marchantia polymorpha). Comme chez Arabidopsis, les plantules de tabac SR-1 cultivées sur un milieu contenant 25 μM de KAND 11 ont produit des racines plus courtes (Fig. 5a). De plus, 40 graines sur 48 ont germé sur des boîtes contenant 200 μM de KAND 11, tandis que les 48 graines ont germé sur des milieux traités à blanc, ce qui indique que des concentrations plus élevées de KAND étaient significatives (pFrançais < 0,05 ; test du chi carré) a inhibé la germination du tabac. (Fig. 5b). De plus, la concentration de KAND 11 qui a inhibé la croissance bactérienne dans l'hépatique était similaire à la concentration efficace dans Arabidopsis (Fig. 5c). Ces résultats indiquent que KAND 11 peut inhiber la croissance d'une variété de plantes. Nous avons ensuite étudié la cytotoxicité possible des composés apparentés au monoamide d'ours dans d'autres organismes, à savoir les cellules HeLa humaines et la souche DH5α d'Escherichia coli, en tant que représentants de cellules animales et bactériennes supérieures, respectivement. Dans une série de tests de prolifération cellulaire, nous avons observé que le coumamonamide 1, l'acide coumamonamidique 6 et KAND 11 n'affectaient pas la croissance des cellules HeLa ou E. coli à des concentrations de 100 μM (Fig. 5d,e).
Inhibition de la croissance de KAND 11 dans des organismes non Arabidopsis. (a) Des plantules de tabac SR-1 de type sauvage âgées de deux semaines ont été cultivées sur des plaques MS positionnées verticalement contenant 25 μM de KAND 11. (b) Des plantules de tabac SR-1 de type sauvage âgées de deux semaines ont été cultivées sur des plaques MS positionnées horizontalement contenant 200 μM de KAND 11. (c) Bourgeons d'hépatique Tak-1 de type sauvage âgés de deux semaines cultivés sur des plaques Gamborg B5 avec les concentrations indiquées de KAND 11. Les flèches rouges indiquent les spores qui ont cessé de croître au cours de la période d'incubation de deux semaines. (d) Test de prolifération cellulaire des cellules HeLa. Le nombre de cellules viables a été mesuré à intervalles de temps fixes à l'aide d'un kit de comptage cellulaire 8 (Dojindo). Comme contrôle, les cellules HeLa ont été traitées avec 5 μg/ml d'actinomycine D (Act D), qui inhibe la transcription de l'ARN polymérase et provoque la mort cellulaire. Les analyses ont été effectuées en triple. (e) Test de prolifération cellulaire d'E. coli. La croissance d'E. coli a été analysée par mesure de la DO600. À titre de contrôle, les cellules ont été traitées avec 50 μg/ml d'ampicilline (Amp), qui inhibe la synthèse de la paroi bactérienne. Les analyses ont été réalisées en triple.
Français Pour déchiffrer le mécanisme d'action de la cytotoxicité causée par les composés apparentés à l'uramide, nous avons réanalysé les dérivés de l'acide urbénique avec des effets inhibiteurs modérés, comme le montre l'image. Comme le montrent les figures 2b, 6a, les semis cultivés sur des plaques d'agar contenant de fortes concentrations (200 μM) d'acide urmotonique 6 ont produit des racines plus courtes et courbées vers la gauche (θ = – 23,7 ± 6,1), tandis que les semis cultivés sur le milieu témoin, les semis ont produit des racines presque droites (θ = – 3,8 ± 7,1). Cette croissance oblique caractéristique est connue pour résulter d'un dysfonctionnement des microtubules corticaux14,18. Conformément à cette découverte, les médicaments déstabilisateurs des microtubules disopyramide et oryzaline ont induit une inclinaison similaire des racines dans nos conditions de croissance (Fig. 2b, 6a). Français Dans le même temps, nous avons testé des dérivés de l'acide urmotonique et sélectionné plusieurs d'entre eux qui, à certaines concentrations, induisaient une croissance oblique des racines. Les composés 8, 9 et 15 ont modifié la direction de la croissance des racines à 75 μM, 50 μM et 40 μM, respectivement, indiquant que ces composés peuvent déstabiliser efficacement les microtubules (Fig. 2b, 6a). Nous avons également testé le dérivé d'acide ursolique le plus puissant, KAND 11, à une concentration plus faible (15 µM) et avons constaté que l'application de KAND 11 inhibait la croissance des racines et que la direction de la croissance des racines était irrégulière, bien qu'elles aient tendance à s'incliner vers la gauche (Figure C3). . Étant donné que des concentrations plus élevées de médicaments déstabilisant les microtubules inhibent parfois la croissance des plantes plutôt que de provoquer une inclinaison des racines, nous avons ensuite évalué la possibilité que KAND 11 affecte les microtubules en observant les microtubules corticaux dans les cellules épidermiques des racines. L'immunohistochimie utilisant des anticorps anti-β-tubuline dans des cellules épidermiques de racines de plantules traitées avec 25 μM de KAND 11 a montré la disparition de la quasi-totalité des microtubules corticaux dans les cellules épidermiques de la zone d'élongation (Fig. 6b). Ces résultats indiquent que l'acide kumamotonique et ses dérivés agissent directement ou indirectement sur les microtubules pour les perturber et que ces composés sont de nouveaux inhibiteurs de ces microtubules.
L'acide ursonique et ses dérivés altèrent les microtubules corticaux chez Arabidopsis thaliana. (a) Angle d'inclinaison racinaire mesuré en présence de divers dérivés de l'acide ursonique aux concentrations indiquées. Les effets de deux composés connus pour inhiber les microtubules : le disopyramide et l'oryzaline, ont également été analysés. L'encart présente la norme utilisée pour mesurer l'angle de croissance racinaire. Les astérisques indiquent les différences significatives avec le traitement fictif (test t, p).< 0,05). n>19. Barre d'échelle = 1 cm. (b) Microtubules corticaux dans les cellules épidermiques de la zone d'élongation. Les microtubules des racines d'Arabidopsis Col de type sauvage cultivées sur des plaques de spectrométrie de masse avec ou sans 25 μM de KAND 11 ont été visualisés par coloration immunohistochimique à l'aide d'anticorps primaires anti-β-tubuline et d'anticorps secondaires conjugués à l'Alexa Fluor. Barre d'échelle = 10 µm. (c) Structure mitotique des microtubules dans le méristème racinaire. Les microtubules ont été visualisés par coloration immunohistochimique. Les structures mitotiques, y compris les zones de prophase, les fuseaux et les phragmoplastes, ont été comptées à partir d'images confocales. Les flèches indiquent les structures des microtubules mitotiques. Les astérisques indiquent les différences significatives avec le traitement simulé (test t, p< 0,05). n>9. Barre d'échelle = 50 µm.
Français Bien qu'Ursa ait la capacité de perturber la fonction des microtubules, son mécanisme d'action devrait être différent de celui des agents dépolymérisants des microtubules typiques. Par exemple, des concentrations plus élevées d'agents dépolymérisants des microtubules tels que le disopyramide et l'oryzaline induisent une expansion anisotrope des cellules épidermiques, contrairement à KAND 11. De plus, la co-application de KAND 11 et de disopyramide a entraîné une réponse combinée de croissance racinaire induite par le disopyramide et une inhibition de la croissance induite par KAND 11 a été observée (Fig. S4). Nous avons également analysé la réponse du mutant hypersensible disopyramide 1-1 (phs1-1) à KAND 11. phs1-1 présente une mutation ponctuelle non canonique de la tubuline kinase et produit des racines plus courtes lorsqu'il est traité avec du disopyramide9,20. Les plantules mutantes phs1-1 cultivées sur un milieu gélosé contenant du KAND 11 avaient des racines plus courtes similaires à celles cultivées sur du disopyramide (fig. S5).
De plus, nous avons observé des structures de microtubules mitotiques, telles que des zones de prophase, des fuseaux et des phragmoplastes, dans le méristème racinaire des plantules traitées avec KAND 11. Conformément aux observations pour CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, une diminution significative du nombre de microtubules mitotiques a été observée (Fig. .6c).
Français Pour caractériser la cytotoxicité de KAND 11 à résolution subcellulaire, nous avons traité des cellules de suspension de tabac BY-2 avec KAND 11 et observé leur réponse. Nous avons d'abord ajouté KAND 11 à des cellules BY-2 exprimant TagRFP-TUA6, qui marque les microtubules par fluorescence, pour évaluer l'effet de KAND 11 sur les microtubules corticaux. La densité des microtubules corticaux a été évaluée par analyse d'image, qui a quantifié le pourcentage de pixels cytosquelettiques parmi les pixels cytoplasmiques. Les résultats du test ont montré qu'après traitement avec 50 μM ou 100 μM de KAND 11 pendant 1 heure, la densité a diminué significativement à 0,94 ± 0,74 % ou 0,23 ± 0,28 %, respectivement, tandis que la densité des cellules traitées au DMSO s'élevait à 1,61 ± 0,34 % (Fig. 7a). Français Ces résultats sont cohérents avec l'observation chez Arabidopsis selon laquelle le traitement au KAND 11 induit la dépolymérisation des microtubules corticaux (Fig. 6b). Nous avons également examiné la lignée BY-2 avec des filaments d'actine marqués au GFP-ABD après traitement avec la même concentration de KAND 11 et avons observé que le traitement au KAND 11 perturbait les filaments d'actine. Le traitement avec 50 μM ou 100 μM de KAND 11 pendant 1 h a réduit de manière significative la densité des filaments d'actine à 1,20 ± 0,62 % ou 0,61 ± 0,26 %, respectivement, tandis que la densité dans les cellules traitées au DMSO était de 1,69 ± 0,51 % (Fig. 2). 7b). Ces résultats contrastent avec les effets du propyzamide, qui n'affecte pas les filaments d'actine, et de la latrunculine B, un dépolymérisateur d'actine qui n'affecte pas les microtubules (SI Figure S6). Français De plus, le traitement avec le coumamonamide 1, l'acide coumamonamide 6 ou KAND 11 n'a pas affecté les microtubules dans les cellules HeLa (SI Figure S7). Ainsi, le mécanisme d'action de KAND 11 est considéré comme différent de celui des perturbateurs du cytosquelette connus. De plus, notre observation microscopique des cellules BY-2 traitées avec KAND 11 a révélé le début de la mort cellulaire pendant le traitement par KAND 11 et a montré que la proportion de cellules mortes colorées au bleu Evans n'a pas augmenté de manière significative après 30 minutes de traitement par KAND 11, alors qu'après 90 minutes de traitement avec 50 μM ou 100 μM de KAND, le nombre de cellules mortes a augmenté à 43,7 % ou 80,1 %, respectivement (Fig. 7c). Prises ensemble, ces données indiquent que le nouveau dérivé de l'acide ursolique KAND 11 est un inhibiteur du cytosquelette spécifique des plantes avec un mécanisme d'action jusqu'alors inconnu.
KAND affecte les microtubules corticaux, les filaments d'actine et la viabilité des cellules BY-2 du tabac. (a) Visualisation des microtubules corticaux dans les cellules BY-2 en présence de TagRFP-TUA6. Les cellules BY-2 traitées avec KAND 11 (50 μM ou 100 μM) ou du DMSO ont été examinées par microscopie confocale. La densité des microtubules corticaux a été calculée à partir de micrographies de 25 cellules indépendantes. Les lettres indiquent les différences significatives (test de Tukey HSD, p< 0,05). Barre d'échelle = 10 µm. (b) Filaments d'actine corticale dans les cellules BY-2 visualisés en présence de GFP-ABD2. Les cellules BY-2 traitées avec KAND 11 (50 µM ou 100 µM) ou DMSO ont été examinées par microscopie confocale. La densité des filaments d'actine corticale a été calculée à partir de micrographies de 25 cellules indépendantes. Les lettres indiquent les différences significatives (test de Tukey HSD, p< 0,05). Barre d'échelle = 10 µm. (c) Observation des cellules BY-2 mortes par coloration au bleu d'Evans. Les cellules BY-2 traitées avec KAND 11 (50 µM ou 100 µM) ou DMSO ont été examinées par microscopie à fond clair. n = 3. Barre d'échelle = 100 µm.
La découverte et l'application de nouveaux produits naturels ont permis des avancées significatives dans divers aspects de la vie humaine, notamment en médecine et en agriculture. Des recherches historiques ont été menées pour obtenir des composés utiles à partir de ressources naturelles. Les actinomycètes sont notamment connus pour leur utilité comme antibiotiques antiparasitaires contre les nématodes, grâce à leur capacité à produire divers métabolites secondaires tels que l'avermectine, principal composé de l'ivermectine, et la bléomycine et ses dérivés, utilisés en médecine comme agent anticancéreux21,22. De même, divers composés herbicides ont été découverts à partir d'actinomycètes, dont certains sont déjà utilisés commercialement1,23. Par conséquent, l'analyse des métabolites des actinomycètes pour isoler des produits naturels aux activités biologiques souhaitées est considérée comme une stratégie efficace. Dans cette étude, nous avons découvert un nouveau composé, le coumamonamide, issu de S. werraensis et l'avons synthétisé avec succès. L'acide ursonique est un intermédiaire synthétique de l'urbénamide et de ses dérivés. Il peut provoquer un enroulement caractéristique des racines, présenter une activité herbicide modérée à forte et endommager directement ou indirectement les microtubules des plantes. Cependant, le mécanisme d'action de l'acide urmotonique pourrait différer de celui des inhibiteurs de microtubules existants, car KAND 11 perturbe également les filaments d'actine et provoque la mort cellulaire, suggérant un mécanisme de régulation par lequel l'acide urmotonique et ses dérivés influencent un large éventail de structures du cytosquelette.
Une caractérisation plus détaillée de l'acide urbénonique permettra de mieux comprendre son mécanisme d'action. L'objectif suivant est d'évaluer la capacité de l'acide uronique à se lier aux microtubules réduits afin de déterminer si l'acide uronique et ses dérivés agissent directement sur les microtubules et les dépolymérisent, ou si leur action entraîne une déstabilisation des microtubules. De plus, lorsque les microtubules ne sont pas une cible directe, l'identification du site d'action et des cibles moléculaires de l'acide uronique sur les cellules végétales permettra de mieux comprendre les propriétés des composés apparentés et d'envisager des pistes pour améliorer l'activité herbicide. Notre test de bioactivité a révélé le pouvoir cytotoxique unique de l'acide uronique sur la croissance de plantes telles qu'Arabidopsis thaliana, le tabac et l'hépatique, sans affecter E. coli ni les cellules HeLa. Une toxicité faible, voire nulle, pour les cellules animales constitue un avantage des dérivés de l'acide uronique s'ils sont développés comme herbicides pour une utilisation en plein champ. Français En effet, les microtubules étant des structures courantes chez les eucaryotes, leur inhibition sélective chez les plantes est une exigence clé pour les herbicides. Par exemple, le propyzamide, un agent dépolymérisant les microtubules qui se lie directement à la tubuline et inhibe la polymérisation, est utilisé comme herbicide en raison de sa faible toxicité pour les cellules animales24. Contrairement au disopyramide, les benzamides apparentés ont des spécificités de cible différentes. Outre les microtubules végétaux, le RH-4032 ou le benzoxamide inhibent également les microtubules des cellules animales ou des oomycètes, respectivement, et le zalilamide est utilisé comme fongicide en raison de sa faible phytotoxicité25,26,27. L'ours récemment découvert et ses dérivés présentent une cytotoxicité sélective contre les plantes, mais il convient de noter que d'autres modifications pourraient altérer leur spécificité de cible, fournissant potentiellement des dérivés supplémentaires pour la lutte contre les champignons pathogènes ou les oomycètes.
Les propriétés uniques de l'acide urbénonique et de ses dérivés sont utiles à leur développement comme herbicides et à leur utilisation comme outils de recherche. L'importance du cytosquelette dans le contrôle de la forme des cellules végétales est largement reconnue. Des études antérieures ont montré que les plantes ont développé des mécanismes complexes d'organisation des microtubules corticaux en contrôlant la dynamique des microtubules afin de contrôler correctement la morphogenèse. Un grand nombre de molécules responsables de la régulation de l'activité des microtubules ont été identifiées, et des recherches connexes sont toujours en cours3,4,28. Notre compréhension actuelle de la dynamique des microtubules dans les cellules végétales n'explique pas entièrement les mécanismes d'organisation des microtubules corticaux. Par exemple, bien que le disopyramide et l'oryzaline puissent tous deux dépolymériser les microtubules, le disopyramide provoque une grave distorsion racinaire, tandis que l'oryzaline a un effet relativement modéré. De plus, les mutations de la tubuline, qui stabilise les microtubules, provoquent également une dextrorotation des racines, contrairement au paclitaxel, qui stabilise également la dynamique des microtubules. Par conséquent, l'étude et l'identification des cibles moléculaires de l'acide ursolique devraient apporter de nouvelles connaissances sur la régulation des microtubules corticaux des plantes. De même, de futures comparaisons entre des substances chimiques efficaces pour favoriser la croissance perturbée, comme le disopyramide, et des substances moins efficaces, comme l'oryzaline ou l'acide kumamotorique, fourniront des indices sur la façon dont se produit cette croissance perturbée.
D'autre part, les réarrangements du cytosquelette liés aux défenses constituent une autre possibilité pour expliquer la cytotoxicité de l'acide ursonique. L'infection par un pathogène ou l'introduction d'un éliciteur dans les cellules végétales provoque parfois la destruction du cytosquelette et la mort cellulaire ultérieure29. Par exemple, il a été rapporté que la cryptoxanthine dérivée d'oomycètes perturbe les microtubules et les filaments d'actine avant la mort des cellules de tabac, de manière similaire à ce qui se produit avec le traitement KAND30,31. Les similitudes entre les réponses de défense et les réponses cellulaires induites par l'acide ursonique nous ont conduits à émettre l'hypothèse qu'elles déclenchent des processus cellulaires communs, bien qu'un effet plus rapide et plus fort de l'acide ursonique que de la cryptoxanthine soit évident. Cependant, des études ont montré que la perturbation des filaments d'actine favorise la mort cellulaire spontanée, qui ne s'accompagne pas toujours d'une perturbation des microtubules29. De plus, il reste à déterminer si le pathogène ou l'éliciteur provoque une croissance racinaire déformée, comme le font les dérivés de l'acide ursonique. Ainsi, les connaissances moléculaires reliant les réponses de défense et le cytosquelette constituent un sujet intéressant à étudier. En exploitant la présence de composés de faible poids moléculaire apparentés à l'acide ursonique, ainsi que d'une gamme de dérivés de puissance variable, ces connaissances pourraient permettre de cibler des mécanismes cellulaires inconnus.
La découverte et l'application de nouveaux composés modulant la dynamique des microtubules offriront des méthodes performantes pour comprendre les mécanismes moléculaires complexes qui sous-tendent la détermination de la forme des cellules végétales. Dans ce contexte, l'acide urmotonique, récemment développé, qui affecte les microtubules et les filaments d'actine et induit la mort cellulaire, pourrait permettre de décrypter le lien entre le contrôle des microtubules et ces autres mécanismes. Ainsi, l'analyse chimique et biologique utilisant l'acide urmotonique nous aidera à comprendre les mécanismes de régulation moléculaire qui contrôlent le cytosquelette végétal.
Inoculer S. werraensis MK493-CF1 dans un erlenmeyer à chicanes de 500 ml contenant 110 ml de milieu d'ensemencement composé de 2 % (p/v) de galactose, 2 % (p/v) de pâte d'essence, 1 % (p/v) de composition Bacto-soja (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5 % (p/v) d'extrait de maïs (KOGOSTCH Co., Ltd., Japon), 0,2 % (p/v) de (NH4)2SO4 et 0,2 % de CaCO3 dans de l'eau déionisée. (pH 7,4 avant stérilisation). Les cultures d'ensemencement ont été incubées sur un agitateur rotatif (180 tr/min) à 27 °C pendant 2 jours. Culture de production par fermentation en milieu solide. Français La culture d'ensemencement (7 ml) a été transférée dans un flacon K-1 de 500 ml contenant 40 g de milieu de production composé de 15 g d'orge pressée (MUSO Co., Ltd., Japon) et de 25 g d'eau déionisée (pH non ajusté avant stérilisation). La fermentation a été réalisée à 30 °C dans l'obscurité pendant 14 jours. Le matériel de fermentation a été extrait avec 40 ml/bouteille d'EtOH et centrifugé (1500 g, 4 °C, 10 min). Le surnageant de culture (60 ml) a été extrait avec un mélange de 10 % MeOH/EtOAc. Français La couche organique a été évaporée sous pression réduite pour obtenir un résidu (59,5 mg), qui a été soumis à une HPLC avec élution en gradient (0–10 minutes : 90 %) sur une colonne en phase inverse (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × longueur 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minutes : 90 % H2O/CH3CN à 70 % H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minutes : 90 % H2O/EtOH, 45–155 minutes : 90 % H2O/EtOH à 100 % EtOH (gradient (gradient), 155–200 min : 100 % EtOH) à un débit de 1,5 ml/min, le coumamonamide (1, 36,0 mg) a été isolé sous forme de poudre amorphe blanche.
Kumamotoamide(1); 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t , J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-RMN (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+ : [C6H9N2O2]+ valeur calculée : 141,0659, valeur mesurée : 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Français Les graines de Columbia (Col-0) ont été obtenues auprès de l'Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) avec l'autorisation d'une utilisation en recherche. Les graines de Col-0 ont été propagées et conservées dans nos conditions de laboratoire et utilisées comme plantes d'Arabidopsis de type sauvage. Les graines d'Arabidopsis ont été stérilisées en surface et cultivées dans un milieu de Murashige et Skoog demi-concentré contenant 2 % de saccharose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05 % (p/v) d'acide 2-(4-morpholino)éthanesulfonique (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ) et 1,5 % d'agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, à 23 °C et lumière constante. Les graines du mutant phs1-1 ont été fournies par T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Les graines de la souche SR-1 ont été fournies par T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) et utilisées comme plants de tabac sauvages. Les graines de tabac ont été stérilisées en surface et trempées dans de l'eau stérile pendant trois nuits pour favoriser la germination, puis placées dans une solution demi-concentrée contenant 2 % de saccharose, 0,05 % (p/v) de MES et 0,8 % de gomme gellane (Fujifilm Wako Pure Chemical) (milieu Murashige et Skoog) à pH 5,7 et incubées à 23 °C sous lumière constante.
La souche Tak-1 a été fournie par T. Kohchi (Université de Kyoto) et a servi d'unité expérimentale standard pour l'étude de l'hépatique. Gemma a été obtenue à partir de plantes cultivées stérilisées, puis ensemencée sur milieu Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) contenant 1 % de saccharose et 0,3 % de gomme gellane, puis incubée à 23 °C sous lumière continue.
Les cellules BY-2 de tabac (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) ont été fournies par S. Hasezawa (Université de Tokyo). Les cellules BY-2 ont été diluées 95 fois dans du milieu Linsmeier et Skoog modifié et supplémentées chaque semaine avec de l'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique 32 . La suspension cellulaire a été mélangée sur un agitateur rotatif à 130 tr/min à 27 °C dans l'obscurité. Les cellules ont été lavées avec 10 fois le volume de milieu frais et remises en suspension dans le même milieu. Des lignées cellulaires transgéniques BY-2 exprimant de manière stable le marqueur de microtubules TagRFP-TUA6 ou le marqueur de filaments d'actine GFP-ABD2 sous le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur ont été générées comme décrit33,34,35. Ces lignées cellulaires peuvent être maintenues et synchronisées en utilisant des procédures similaires à celles utilisées pour la lignée cellulaire BY-2 originale.
Les cellules HeLa ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) supplémenté avec 10 % de sérum fœtal bovin, 1,2 U/ml de pénicilline et 1,2 μg/ml de streptomycine dans un incubateur à 37°C avec 5 % de CO2.
Toutes les expériences décrites dans ce manuscrit ont été réalisées conformément aux réglementations et directives japonaises en matière de biosécurité.
Les composés ont été dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO ; Fujifilm Wako Pure Chemical) comme solutions mères et dilués dans du milieu MS pour Arabidopsis et le tabac ou du milieu Gamborg B5 pour l'hépatique. Pour le test d'inhibition de la croissance racinaire, plus de 10 graines par boîte ont été semées sur un milieu gélosé contenant les composés indiqués ou du DMSO. Les graines ont été incubées en chambre de culture pendant 7 jours. Les plantules ont été photographiées et la longueur des racines a été mesurée. Pour le test de germination d'Arabidopsis, 48 graines par boîte ont été semées sur un milieu gélosé contenant 200 μM du composé ou du DMSO. Les graines d'Arabidopsis ont été cultivées en chambre de culture et le nombre de plantules germées a été compté 7 jours après la germination (dag). Pour le test de germination du tabac, 24 graines par boîte ont été semées sur un milieu gélosé contenant 200 μM de KAND ou de DMSO. Les graines de tabac ont été cultivées en chambre de culture et le nombre de plantules germées a été compté après 14 jours. Pour le test d'inhibition de la croissance de l'hépatique, 9 embryons de chaque plaque ont été plaqués sur un milieu gélosé contenant les concentrations indiquées de KAND ou de DMSO et incubés dans une chambre de croissance pendant 14 jours.
Utiliser des plantules colorées avec 5 mg/ml d'iodure de propidium (IP) pour visualiser l'organisation du méristème racinaire. Les signaux d'IP ont été observés par microscopie à fluorescence à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser TCS SPE (Leica Microsystems).
Français La coloration histochimique des racines avec la β-glucuronidase (GUS) a été réalisée selon le protocole décrit par Malami et Benfey36. Les plantules ont été fixées dans de l'acétone à 90 % pendant une nuit, colorées avec 0,5 mg/ml d'acide 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronique dans un tampon GUS pendant 1 heure et placées dans une solution de chloraldéhyde hydratée. (8 g d'hydrate de chloral, 2 ml d'eau et 1 ml de glycérol) et observées par microscopie à contraste interférentiel différentiel à l'aide d'un microscope Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Les angles des racines ont été mesurés sur des semis de 7 jours cultivés sur des plaques placées verticalement. Mesurez l'angle de la racine par rapport à la direction du vecteur de gravité, comme décrit à l'étape 6.
Français La disposition des microtubules corticaux a été observée comme décrit, avec des modifications mineures au protocole 37 . L'anticorps anti-β-tubuline (KMX-1, Merk Millipore : MAB3408) et l'IgG anti-souris conjuguée à Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific : A32723) ont été utilisés comme anticorps primaires et secondaires à des dilutions de 1:1000 et 1:100, respectivement. Les images de fluorescence ont été acquises à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser TCS SPE (Leica Microsystems). Acquérir des images Z-stack et créer des projections d'intensité maximale selon les instructions du fabricant.
Le test de prolifération des cellules HeLa a été réalisé à l'aide du kit de comptage cellulaire 8 (Dojindo) conformément aux instructions du fabricant.
La croissance d'E. coli DH5α a été analysée en mesurant la densité cellulaire en culture à l'aide d'un spectrophotomètre à 600 nm (OD600).
L'organisation du cytosquelette dans les cellules transgéniques BY-2 a été observée à l'aide d'un microscope à fluorescence équipé d'un dispositif de balayage confocal CSU-X1 (Yokogawa) et d'une caméra sCMOS (Zyla, Andor Technology). La densité du cytosquelette a été évaluée par analyse d'image, qui a quantifié le pourcentage de pixels du cytosquelette parmi les pixels cytoplasmiques dans les images confocales à l'aide du logiciel ImageJ, comme décrit38,39.
Pour détecter la mort cellulaire dans les cellules BY-2, une aliquote de la suspension cellulaire a été incubée avec 0,05 % de bleu Evans pendant 10 minutes à température ambiante. La coloration sélective au bleu Evans des cellules mortes dépend de l'extrusion du colorant des cellules viables par la membrane plasmique intacte40. Les cellules colorées ont été observées à l'aide d'un microscope à fond clair (BX53, Olympus).
Français Les cellules HeLa ont été cultivées dans du DMEM supplémenté avec 10 % de FBS dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2. Les cellules ont été traitées avec 100 μM de KAND 11, d'acide kumamonamique 6, de kumamonamide 1, 100 ng/ml de colcémide (Gibco) ou 100 ng/ml de Nocodmaze (Sigma) pendant 6 h à 37 °C. Les cellules ont été fixées avec du MetOH pendant 10 min, puis avec de l'acétate pendant 5 min à température ambiante. Les cellules fixées ont été incubées avec l'anticorps primaire β-tubuline (1D4A4, Proteintech : 66240-1) dilué dans 0,5 % de BSA/PBS pendant 2 heures, lavées 3 fois avec du TBST, puis incubées avec l'anticorps de chèvre Alexa Fluor. 488 1 heure. – IgG de souris (Thermo Fisher Scientific : A11001) et 15 ng/ml de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dilués dans 0,5 % de BSA/PBS. Après trois lavages au TBST, les cellules colorées ont été observées au microscope inversé Nikon Eclipse Ti-E. Les images ont été capturées avec une caméra CCD Hamamatsu ORCA-R2 refroidie et le logiciel MetaMorph (Molecular Devices).
Date de publication : 17 juin 2024