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La découverte et l’utilisation bénéfique de produits naturels peuvent contribuer à améliorer la vie humaine.Les produits chimiques inhibiteurs de croissance des plantes sont largement utilisés comme herbicides pour lutter contre les mauvaises herbes.En raison de la nécessité d’utiliser différents types d’herbicides, il est nécessaire d’identifier des composés dotés de nouveaux mécanismes d’action.Dans cette étude, nous avons découvert un nouveau composé N-alcoxypyrrole, le coumamonamide, de Streptomyces werraensis MK493-CF1 et établi le processus de synthèse complet.Grâce à des tests d'activité biologique, nous avons découvert que l'acide urs-monoamique est un intermédiaire synthétique de l'urs-monoamide et un potentielinhibiteur de croissance des plantes.De plus, nous avons développé divers dérivés de l'acide urbénique, dont le dérivé urbényloxy (UDA), qui possède une activité herbicide élevée sans affecter négativement la croissance des cellules HeLa.Nous avons également constaté que les dérivés de l'acide urmotonique perturbent les microtubules des plantes ;de plus, KAND affecte les filaments d'actine et induit la mort cellulaire ;Ces effets multiformes diffèrent de ceux des inhibiteurs de microtubules connus et suggèrent un nouveau mécanisme d'action pour l'acide ursonique, ce qui représente un avantage important dans le développement de nouveaux herbicides.
La découverte et l'application pratique de produits naturels bénéfiques et de leurs dérivés sont un moyen d'améliorer la qualité de la vie humaine.Les métabolites secondaires produits par les micro-organismes, les plantes et les insectes ont conduit à des progrès majeurs en médecine et en agriculture.De nombreux antibiotiques et médicaments anti-leucémiques ont été développés à partir de produits naturels.De plus, divers types depesticides, des fongicides et des herbicides sont extraits de ces produits naturels pour être utilisés en agriculture.En particulier, les herbicides de lutte contre les mauvaises herbes sont des outils importants pour augmenter les rendements des cultures dans l’agriculture moderne, et divers types de composés sont déjà utilisés commercialement.Plusieurs processus cellulaires chez les plantes, tels que la photosynthèse, le métabolisme des acides aminés, la synthèse de la paroi cellulaire, la régulation de la mitose, la signalisation des phytohormones ou la synthèse des protéines, sont considérés comme des cibles typiques des herbicides.Les composés qui inhibent la fonction des microtubules constituent une classe courante d'herbicides qui affectent la croissance des plantes en affectant la régulation mitotique2.
Les microtubules sont des composants du cytosquelette et sont largement conservés dans les cellules eucaryotes.L'hétérodimère de tubuline est constitué de α-tubuline et de β-tubuline formant des protofilaments de microtubules linéaires, avec 13 protofilaments formant une structure cylindrique.Les microtubules jouent de multiples rôles dans les cellules végétales, notamment la détermination de la forme cellulaire, la division cellulaire et le transport intracellulaire3,4.Les cellules végétales contiennent des microtubules sous la membrane plasmique interphase, et on pense que ces microtubules corticaux contrôlent l’organisation des microfibrilles de cellulose grâce à la régulation des complexes de cellulose synthase4,5.Les microtubules corticaux des cellules épidermiques de la racine, présents dans la zone d'élongation rapide de l'extrémité de la racine, sont situés latéralement, et les microfibres de cellulose suivent ces microtubules et limitent la direction de l'expansion cellulaire, favorisant ainsi l'élongation cellulaire anisotrope.La fonction des microtubules est donc étroitement liée à la morphologie des plantes.Les substitutions d'acides aminés dans les gènes codant pour la tubuline provoquent une distorsion des réseaux de microtubules corticaux et une croissance du côté gauche ou droit chez Arabidopsis 6,7.De même, des mutations dans les protéines associées aux microtubules qui régulent la dynamique des microtubules peuvent également conduire à une croissance racinaire déformée8,9,10,11,12,13.De plus, le traitement avec des herbicides perturbateurs des microtubules tels que le disopyramide, également connu sous le nom de prétilachlore, provoque également une croissance des racines obliques du côté gauche14.Ces données indiquent qu'une régulation précise de la fonction des microtubules est essentielle pour déterminer la direction de la croissance des plantes.
Différents types d'inhibiteurs de microtubules ont été découverts et ces médicaments ont apporté une contribution significative à la recherche sur le cytosquelette, ainsi qu'à l'agriculture et à la médecine2.En particulier, l'oryzaline, les composés de dinitroaniline, le disopyramide, les composés apparentés au benzamide et leurs analogues peuvent inhiber la fonction des microtubules et ainsi inhiber la croissance des plantes.C’est pourquoi ils sont largement utilisés comme herbicides.Cependant, les microtubules étant un composant important des cellules végétales et animales, la plupart des inhibiteurs de microtubules sont cytotoxiques pour les deux types de cellules.Par conséquent, malgré leur utilité reconnue comme herbicides, un nombre limité d’agents antimicrotubules sont utilisés à des fins pratiques.
Streptomyces est un genre de la famille des Streptomyces, qui comprend des bactéries filamenteuses aérobies, à Gram positif, et est largement connu pour sa capacité à produire une large gamme de métabolites secondaires.C’est pourquoi il est considéré comme l’une des sources les plus importantes de nouveaux produits naturels biologiquement actifs.Dans la présente étude, nous avons découvert un nouveau composé appelé coumamonamide, isolé de Streptomyces werraensis MK493-CF1 et de S. werraensis ISP 5486. À l'aide d'une analyse spectrale et d'une analyse spectrale complète, la structure du coumamonamide a été caractérisée ainsi que son squelette unique de N-alcoxypyrrole. était déterminé.la synthèse.L'acide ursmonique, un intermédiaire synthétique de l'ursmonoamide et de ses dérivés, s'est avéré inhiber la croissance et la germination de la plante modèle populaire Arabidopsis thaliana.Dans une étude sur la relation structure-activité, nous avons constaté qu'un composé dont le C9 est modifié en acide ursonique, appelé dérivé nonyloxy de l'acide ursonique (KAND), améliore considérablement l'effet inhibiteur sur la croissance et la germination.Notamment, l’inhibiteur de croissance des plantes récemment découvert a également affecté la croissance du tabac et de l’hépatique et n’était pas cytotoxique pour les bactéries ou les cellules HeLa.De plus, certains dérivés de l’acide urmotonique induisent une distorsion du phénotype racinaire, ce qui implique que ces dérivés affectent directement ou indirectement les microtubules.Conformément à cette idée, nos observations de microtubules marqués soit par voie immunohistochimique, soit avec des protéines fluorescentes indiquent que le traitement KAND dépolymérise les microtubules.De plus, le traitement avec des dérivés de l’acide kumamotonique a perturbé les microfilaments d’actine.Ainsi, nous avons découvert un nouvel inhibiteur de croissance végétale dont le mécanisme d’action unique implique la destruction du cytosquelette.
La souche MK493-CF1 a été isolée du sol à Shinagawa-ku, Tokyo.La souche MK493-CF1 a formé un mycélium stromal bien ramifié.La séquence partielle du gène de l'ARN ribosomal 16S (1422 pb) a été déterminée.Cette souche est très similaire à S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 pb, T : souche typique, 99,93 %).Sur la base de ce résultat, il a été déterminé que cette souche était étroitement apparentée à la souche type de S. werraensis.Par conséquent, nous avons provisoirement nommé cette souche S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T produit également les mêmes composés bioactifs.Comme il y avait peu de recherches initiales sur l’obtention de produits naturels à partir de ce micro-organisme, d’autres recherches chimiques ont été menées.Après culture de S. werraensis MK493-CF1 sur milieu d'orge par fermentation à l'état solide à 30°C pendant 14 jours, le milieu a été extrait avec 50 % d'EtOH.60 ml d'échantillon ont été séchés pour obtenir 59,5 mg d'extrait brut.L'extrait brut a été soumis à une HPLC en phase inverse pour donner le N-méthoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, nommé coumamonamide, 36,0 mg).La quantité totale de 1 représente environ 60 % de l'extrait brut.Par conséquent, nous avons décidé d’étudier en détail les propriétés du kumamotoamide 1.
Le coumamonamide 1 est une poudre amorphe blanche et la spectrométrie de masse à haute résolution (HRESIMS) confirme C6H8N2O2 (Fig. 1).Le fragment pyrrole substitué en C2 de ce composé est caractérisé par δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH dans le spectre RMN 1H : 4,5 Hz. , H-5) et δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), et le spectre RMN 13C montre la présence de quatre atomes de carbone sp2.La présence d'un groupe amide en position C2 a été évaluée par corrélation HMBC du proton C-3 au carbone amide carbonyle à δC 161,1.De plus, les pics de RMN 1 H et 13 C à δH 4,10 (3H, S) et δC 68,3 indiquent la présence de groupes N-méthoxy dans la molécule.Bien que la position correcte du groupe méthoxy n'ait pas encore été déterminée à l'aide d'une analyse spectroscopique telle que la spectroscopie différentielle améliorée et l'abréviation nucléaire Overhauser (NOEDF), le N-méthoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide est devenu le premier composé candidat.
Pour déterminer la structure correcte de 1, une synthèse totale a été réalisée (Fig. 2a).Le traitement de la 2-aminopyridine 2 disponible dans le commerce avec le m-CPBA a abouti au N-oxyde 3 correspondant avec un rendement quantitatif.Après la 2-aminoazidation de 2, la réaction de cyclocondensation décrite par Abramovich a été réalisée dans du benzène à 90°C pour obtenir le 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 souhaité en grammes.Vitesse 60% (deux étapes).15,16.La méthylation et l'hydrolyse de 4 ont ensuite donné l'acide 1-méthoxy-1H-pyrrole-2-carboxylique (appelé « acide cumotonique », 6) avec un bon rendement (70 %, deux étapes).Enfin, l'amidation via l'intermédiaire chlorure d'acide 6 en utilisant de l'ammoniaque aqueuse a donné l'amide de Kumamoto 1 avec un rendement de 98 %.Toutes les données spectrales du 1 synthétisé étaient similaires à celles du 1 isolé, la structure de 1 a donc été déterminée ;
Synthèse générale et analyse de l'activité biologique de l'urbénamide et de l'acide urbénique.( a ) Synthèse totale de l'amide de Kumamoto.(b) Des semis d'Arabidopsis Columbia (Col) de type sauvage âgés de sept jours ont été cultivés sur des plaques Murashige et Skoog (MS) contenant du coumamonamide 6 ou du coumamonamide 1 aux concentrations indiquées.Barre d'échelle = 1 cm.
Premièrement, nous avons évalué les activités biologiques de l'urbénamide et de ses intermédiaires pour leur capacité à moduler la croissance des plantes.Nous avons ajouté diverses concentrations d'ursmonamide 1 ou d'acide ursmonique 6 au milieu gélose MS et cultivé des plants d'Arabidopsis thaliana sur ce milieu.Ces analyses ont montré que des concentrations élevées (500 μM) de 6 inhibaient la croissance des racines (Fig. 2b).Ensuite, nous avons généré diverses dérivées en substituant la position N1 de 6 et effectué des études de relation structure-activité sur celles-ci (le processus de synthèse analogique est décrit dans les informations complémentaires (SI)).Les plants d'Arabidopsis ont été cultivés sur un milieu contenant 50 µM de dérivés d'acide ursonique et la longueur des racines a été mesurée.comme le montre la photo.Comme le montrent les figures 3a, b et S1, les acides coumamo ont différentes longueurs de chaînes alcoxy linéaires (9, 10, 11, 12 et 13) ou de grandes chaînes alcoxy (15, 16 et 17) en position N1.Les dérivés ont montré une inhibition significative de la croissance des racines.De plus, nous avons constaté que l'application de 200 μM 10, 11 ou 17 inhibait la germination (figures 3c et S2).
Etude de la relation structure-activité de l'amide de Kumamoto et des composés apparentés.(a) Structure et schéma de synthèse des analogues.(b) Quantification de la longueur des racines de plants âgés de 7 jours cultivés sur du milieu MS avec ou sans dérivés de coumamonamide 50 μM.Les astérisques indiquent des différences significatives avec le traitement fictif (test t, p< 0,05).n>18. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD.nt signifie « non testé » car plus de 50 % des graines n’ont pas germé.(c) Quantification du taux de germination des graines traitées incubées pendant 7 jours dans un milieu MS avec ou sans 200 μM de coumamonamide et composés apparentés.Les astérisques indiquent des différences significatives avec le traitement fictif (test du chi carré).n = 96.
Il est intéressant de noter que l’ajout de chaînes latérales alkyles plus longues que C9 a réduit l’activité inhibitrice, ce qui suggère que les composés liés à l’acide kumamotoique nécessitent des chaînes latérales d’une certaine taille pour présenter leur activité biologique.
Étant donné que l'analyse de la relation structure-activité a montré que C9 a été modifié en acide ursonique et que le dérivé nonyloxy de l'acide ursonique (ci-après dénommé KAND 11) était l'inhibiteur de croissance des plantes le plus efficace, nous avons procédé à une caractérisation plus détaillée de KAND 11. Traitement d'Arabidopsis avec 50 μM de KAND 11 empêchait presque complètement la germination, alors que des concentrations plus faibles (40, 30, 20 ou 10 μM) de KAND 11 inhibaient la croissance des racines de manière dépendante de la dose (Fig. 4a, b).Pour tester si KAND 11 affecte la viabilité des méristèmes racinaires, nous avons examiné les méristèmes racinaires colorés à l'iodure de propidium (PI) et mesuré la taille de la zone des méristèmes.La taille du méristème des plantules cultivées sur un milieu contenant 25 μM de KAND-11 était de 151,1 ± 32,5 μm, tandis que la taille du méristème des plantules cultivées sur un milieu témoin contenant du DMSO était de 264,7 ± 30,8 μm (Fig. 4c, d) , ce qui indique que KAND-11 rétablit l'activité cellulaire.diffusion.Méristème racine.Conformément à cela, le traitement KAND 11 a réduit la quantité de signal du marqueur de division cellulaire CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS dans le méristème racinaire (Fig. 4e) 17.Ces résultats indiquent que KAND 11 inhibe la croissance des racines en réduisant l'activité de prolifération cellulaire.
Analyse de l'effet inhibiteur des dérivés de l'acide urbénique (dérivés urbényloxy) sur la croissance.(a) Semis de Col de type sauvage âgés de 7 jours cultivés sur des plaques MS avec les concentrations indiquées de KAND 11. Barre d'échelle = 1 cm.(b) Quantification de la longueur des racines.Les lettres indiquent des différences significatives (test Tukey HSD, p< 0,05).n>16. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD.(c) Microscopie confocale de racines de Col de type sauvage colorées à l'iodure de propidium cultivées sur des plaques MS avec ou sans 25 μM de KAND 11. Les parenthèses blanches indiquent le méristème racinaire.Barre d'échelle = 100 µm.(d) Quantification de la taille du méristème racinaire (n = 10 à 11).Les différences statistiques ont été déterminées à l'aide du test t (p< 0,05).Les barres représentent la taille moyenne des méristèmes.(e) Microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC) d'un méristème racinaire contenant la construction CDKB2 ;1pro : CDKB2 ;Coloré au 1-GUS et coloré sur des plants âgés de 5 jours cultivés sur des plaques MS avec ou sans test KAND 25 µM.
La phytotoxicité de KAND 11 a ensuite été testée en utilisant une autre plante dicotylédone, le tabac (Nicotiana tabacum), et un organisme modèle végétal majeur, l'hépatique (Marchantia polymorpha).Comme dans le cas d'Arabidopsis, les plants de tabac SR-1 cultivés sur un milieu contenant 25 µM de KAND 11 ont produit des racines plus courtes (Fig. 5a).De plus, 40 des 48 graines ont germé sur des plaques contenant 200 μM de KAND 11, alors que les 48 graines ont germé sur un milieu traité simulé, ce qui indique que des concentrations plus élevées de KAND étaient significatives (p< 0,05 ;test chi -carré) inhibe la germination du tabac.(Fig. 5b).De plus, la concentration de KAND 11 qui inhibait la croissance bactérienne dans l'hépatique était similaire à la concentration efficace chez Arabidopsis (Fig. 5c).Ces résultats indiquent que KAND 11 peut inhiber la croissance de diverses plantes.Nous avons ensuite étudié la cytotoxicité possible des composés apparentés au monoamide d'ours dans d'autres organismes, à savoir les cellules HeLa humaines et la souche DH5α d'Escherichia coli, en tant que représentants de cellules animales et bactériennes supérieures, respectivement.Dans une série de tests de prolifération cellulaire, nous avons observé que le coumamonamide 1, l'acide coumamonamidique 6 et KAND 11 n'affectaient pas la croissance des cellules HeLa ou E. coli à des concentrations de 100 μM (Fig. 5d, e).
Inhibition de la croissance de KAND 11 chez les organismes non-Arabidopsis.(a) Des plants de tabac SR-1 de type sauvage âgés de deux semaines ont été cultivés sur des plaques MS positionnées verticalement contenant 25 µM de KAND 11. (b) Des plants de tabac SR-1 de type sauvage âgés de deux semaines ont été cultivés sur des plaques positionnées horizontalement. Plaques MS contenant 200 μM de KAND 11. (c) Bourgeons d'hépatique Tak-1 de type sauvage âgés de deux semaines cultivés sur des plaques Gamborg B5 avec les concentrations indiquées de KAND 11. Les flèches rouges indiquent les spores qui ont cessé de croître au cours des deux semaines d'incubation. période.( d ) Test de prolifération cellulaire de cellules HeLa.Le nombre de cellules viables a été mesuré à intervalles de temps fixes à l'aide d'un kit de comptage cellulaire 8 (Dojindo).À titre de contrôle, les cellules HeLa ont été traitées avec 5 µg/ml d'actinomycine D (Act D), qui inhibe la transcription de l'ARN polymérase et provoque la mort cellulaire.Les analyses ont été effectuées en triple.(e) Test de prolifération cellulaire d'E. coli.La croissance d'E. coli a été analysée en mesurant la DO600.À titre de contrôle, les cellules ont été traitées avec 50 µg/ml d'ampicilline (Amp), qui inhibe la synthèse de la paroi cellulaire bactérienne.Les analyses ont été effectuées en triple.
Pour décrypter le mécanisme d'action de la cytotoxicité provoquée par les composés apparentés à l'uramide, nous avons réanalysé les dérivés de l'acide urbénique ayant des effets inhibiteurs modérés.comme le montre la photo.Comme le montrent les figures 2b et 6a, les plants cultivés sur des plaques de gélose contenant des concentrations élevées (200 µM) d'acide urmotonique 6 ont produit des racines plus courtes et courbées vers la gauche (θ = – 23,7 ± 6,1), alors que chez les plants cultivés sur le milieu témoin, le les semis ont produit des racines presque droites (θ = – 3,8 ± 7,1).On sait que cette croissance oblique caractéristique résulte d’un dysfonctionnement des microtubules corticaux14,18.Conformément à cette découverte, les médicaments déstabilisateurs des microtubules, le disopyramide et l'oryzaline, ont induit une inclinaison similaire des racines dans nos conditions de croissance (Fig. 2b, 6a).Parallèlement, nous avons testé des dérivés de l'acide urmotonique et en avons sélectionné plusieurs qui, à certaines concentrations, induisaient une croissance oblique des racines.Les composés 8, 9 et 15 ont modifié la direction de la croissance des racines à 75 μM, 50 μM et 40 μM, respectivement, indiquant que ces composés peuvent déstabiliser efficacement les microtubules (Fig. 2b, 6a).Nous avons également testé le dérivé d'acide ursolique le plus puissant, KAND 11, à une concentration plus faible (15 µM) et avons constaté que l'application de KAND 11 inhibait la croissance des racines et que la direction de la croissance des racines était inégale, bien qu'elles aient tendance à s'incliner vers la gauche ( Figure C3)..Étant donné que des concentrations plus élevées de médicaments déstabilisant les microtubules inhibent parfois la croissance des plantes plutôt que de provoquer l'inclinaison des racines, nous avons ensuite évalué la possibilité que KAND 11 affecte les microtubules en observant les microtubules corticaux dans les cellules épidermiques des racines.L'immunohistochimie utilisant des anticorps anti-β-tubuline dans des cellules épidermiques de racines de plantules traitées avec 25 µM de KAND 11 a montré la disparition de presque tous les microtubules corticaux dans les cellules épidermiques de la zone d'élongation (Fig. 6b).Ces résultats indiquent que l'acide kumamotonique et ses dérivés agissent directement ou indirectement sur les microtubules pour les perturber et que ces composés sont de nouveaux inhibiteurs de microtubules.
L'acide ursonique et ses dérivés altèrent les microtubules corticaux chez Arabidopsis thaliana.(a) Angle d'inclinaison des racines mesuré en présence de divers dérivés de l'acide urmotonique aux concentrations indiquées.Les effets de deux composés connus pour inhiber les microtubules : le disopyramide et l'oryzaline ont également été analysés.L'encadré montre la norme utilisée pour mesurer l'angle de croissance des racines.Les astérisques indiquent des différences significatives avec le traitement fictif (test t, p< 0,05).n>19. Barre d'échelle = 1 cm.(b) Microtubules corticaux dans les cellules épidermiques de la zone d'élongation.Les microtubules dans les racines d'Arabidopsis Col de type sauvage cultivées sur des plaques MS avec ou sans 25 μM de KAND 11 ont été visualisés par coloration immunohistochimique à l'aide d'anticorps primaires β-tubuline et d'anticorps secondaires conjugués à Alexa Fluor.Barre d'échelle = 10 µm.(c) Structure mitotique des microtubules dans le méristème racinaire.Les microtubules ont été visualisés par coloration immunohistochimique.Les structures mitotiques, y compris les zones de prophase, les fuseaux et les phragmoplastes, ont été comptées à partir d'images confocales.Les flèches indiquent les structures de microtubules mitotiques.Les astérisques indiquent des différences significatives avec le traitement fictif (test t, p< 0,05).n>9. Barre d’échelle = 50 µm.
Bien qu'Ursa ait la capacité de perturber la fonction des microtubules, son mécanisme d'action devrait être différent de celui des agents dépolymérisants typiques des microtubules.Par exemple, des concentrations plus élevées d'agents dépolymérisants de microtubules tels que le disopyramide et l'oryzaline induisent une expansion anisotrope des cellules épidermiques, contrairement à KAND 11.De plus, l'application conjointe de KAND 11 et de disopyramide a entraîné une réponse combinée de croissance des racines induite par le disopyramide et une inhibition de la croissance induite par KAND 11 a été observée (Fig. S4).Nous avons également analysé la réponse du mutant hypersensible disopyramide 1-1 (phs1-1) à KAND 11. phs1-1 présente une mutation ponctuelle non canonique de la tubuline kinase et produit des racines plus courtes lorsqu'il est traité avec du disopyramide9,20.Les plants mutants phs1-1 cultivés sur un milieu gélosé contenant KAND 11 avaient des racines plus courtes, similaires à celles cultivées sur du disopyramide (fig. S5).
De plus, nous avons observé des structures de microtubules mitotiques, telles que des zones de prophase, des fuseaux et des phragmoplastes, dans le méristème racinaire des semis traités avec KAND 11. Conformément aux observations pour CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, une diminution significative de le nombre de microtubules mitotiques a été observé (Fig. .6c).
Pour caractériser la cytotoxicité de KAND 11 à résolution subcellulaire, nous avons traité des cellules en suspension BY-2 de tabac avec KAND 11 et observé leur réponse.Nous avons d'abord ajouté KAND 11 aux cellules BY-2 exprimant TagRFP-TUA6, qui marque les microtubules par fluorescence, afin d'évaluer l'effet de KAND 11 sur les microtubules corticaux.La densité des microtubules corticaux a été évaluée à l'aide d'une analyse d'image, qui a quantifié le pourcentage de pixels cytosquelettiques parmi les pixels cytoplasmiques.Les résultats du test ont montré qu'après traitement avec 50 μM ou 100 μM de KAND 11 pendant 1 heure, la densité a diminué de manière significative à 0,94 ± 0,74 % ou 0,23 ± 0,28 %, respectivement, tandis que la densité des cellules traitées au DMSO s'élevait à 1,61 ± 0,34. % (figure 7a).Ces résultats concordent avec l'observation chez Arabidopsis selon laquelle le traitement KAND 11 induit une dépolymérisation des microtubules corticaux (Fig. 6b).Nous avons également examiné la lignée BY-2 avec des filaments d'actine marqués au GFP-ABD après un traitement avec la même concentration de KAND 11 et avons observé que le traitement par KAND 11 perturbait les filaments d'actine.Le traitement avec 50 μM ou 100 μM de KAND 11 pendant 1 h a réduit de manière significative la densité du filament d'actine à 1,20 ± 0,62 % ou 0,61 ± 0,26 %, respectivement, alors que la densité dans les cellules traitées au DMSO était de 1,69 ± 0,51 % (Fig. 2).7b).Ces résultats contrastent avec les effets du propyzamide, qui n'affecte pas les filaments d'actine, et de la latrunculine B, un dépolymériseur d'actine qui n'affecte pas les microtubules ( SI Figure S6).De plus, le traitement par le coumamonamide 1, l'acide coumamonamide 6 ou le KAND 11 n'a pas affecté les microtubules des cellules HeLa (SI Figure S7).Ainsi, le mécanisme d’action de KAND 11 serait différent de celui des perturbateurs connus du cytosquelette.De plus, notre observation microscopique de cellules BY-2 traitées avec KAND 11 a révélé le début de la mort cellulaire au cours du traitement KAND 11 et a montré que la proportion de cellules mortes colorées en bleu Evans n'a pas augmenté de manière significative après 30 minutes de traitement KAND 11, alors que après 90 minutes de traitement avec 50 μM ou 100 μM de KAND, le nombre de cellules mortes a augmenté respectivement à 43,7 % ou 80,1 % (Fig. 7c).Prises ensemble, ces données indiquent que le nouveau dérivé de l’acide ursolique KAND 11 est un inhibiteur cytosquelettique spécifique aux plantes doté d’un mécanisme d’action jusqu’alors inconnu.
KAND affecte les microtubules corticaux, les filaments d'actine et la viabilité des cellules BY-2 du tabac.( a ) Visualisation des microtubules corticaux dans les cellules BY-2 en présence de TagRFP-TUA6.Les cellules BY-2 traitées avec KAND 11 (50 μM ou 100 μM) ou DMSO ont été examinées par microscopie confocale.La densité des microtubules corticaux a été calculée à partir de micrographies de 25 cellules indépendantes.Les lettres indiquent des différences significatives (test Tukey HSD, p< 0,05).Barre d'échelle = 10 µm.(b) Filaments d'actine corticaux dans les cellules BY-2 visualisés en présence de GFP-ABD2.Les cellules BY-2 traitées avec KAND 11 (50 μM ou 100 μM) ou DMSO ont été examinées par microscopie confocale.La densité des filaments d'actine corticaux a été calculée à partir de micrographies de 25 cellules indépendantes.Les lettres indiquent des différences significatives (test Tukey HSD, p< 0,05).Barre d'échelle = 10 µm.( c ) Observation de cellules BY-2 mortes par coloration au bleu Evans.Les cellules BY-2 traitées avec KAND 11 (50 μM ou 100 μM) ou DMSO ont été examinées par microscopie à fond clair.n=3.Barre d'échelle = 100 µm.
La découverte et l'application de nouveaux produits naturels ont conduit à des progrès significatifs dans divers aspects de la vie humaine, notamment la médecine et l'agriculture.Des recherches historiques ont été menées pour obtenir des composés utiles à partir de ressources naturelles.En particulier, les actinomycètes sont connus pour être utiles comme antibiotiques antiparasitaires contre les nématodes en raison de leur capacité à produire divers métabolites secondaires tels que l'avermectine, le composé principal de l'ivermectine et de la bléomycine et ses dérivés, utilisés en médecine comme agent anticancéreux21,22.De même, divers composés herbicides ont été découverts à partir des actinomycètes, dont certains sont déjà utilisés commercialement1,23.Par conséquent, l’analyse des métabolites des actinomycètes pour isoler les produits naturels présentant les activités biologiques souhaitées est considérée comme une stratégie efficace.Dans cette étude, nous avons découvert un nouveau composé, le coumamonamide, de S. werraensis et l’avons synthétisé avec succès.L'acide ursonique est un intermédiaire synthétique de l'urbénamide et de ses dérivés.Il peut provoquer un enroulement caractéristique des racines, présenter une activité herbicide modérée à forte et endommager directement ou indirectement les microtubules des plantes.Cependant, le mécanisme d'action de l'acide urmotonique peut différer de celui des inhibiteurs de microtubules existants, puisque KAND 11 perturbe également les filaments d'actine et provoque la mort cellulaire, suggérant un mécanisme de régulation par lequel l'acide urmotonique et ses dérivés influencent un large éventail de structures cytosquelettiques..
Une caractérisation plus détaillée de l’acide urbénique aidera à mieux comprendre le mécanisme d’action de l’acide urbénique.En particulier, le prochain objectif est d'évaluer la capacité de l'acide ursonique à se lier aux microtubules réduits afin de déterminer si l'acide ursonique et ses dérivés agissent directement sur les microtubules et les dépolymérisent, ou si leur action entraîne une déstabilisation des microtubules.De plus, dans le cas où les microtubules ne sont pas une cible directe, l’identification du site d’action et des cibles moléculaires de l’acide ursonique sur les cellules végétales permettra de mieux comprendre les propriétés des composés apparentés et les moyens possibles d’améliorer l’activité herbicide.Notre test de bioactivité a révélé la capacité cytotoxique unique de l'acide ursonique sur la croissance de plantes telles qu'Arabidopsis thaliana, le tabac et l'hépatique, alors que ni les cellules d'E. coli ni les cellules HeLa n'étaient affectées.Peu ou pas de toxicité pour les cellules animales constitue un avantage des dérivés de l'acide ursonique s'ils sont développés comme herbicides destinés à être utilisés dans les champs agricoles ouverts.En effet, puisque les microtubules sont des structures courantes chez les eucaryotes, leur inhibition sélective chez les plantes est une exigence clé pour les herbicides.Par exemple, le propyzamide, un agent dépolymérisant des microtubules qui se lie directement à la tubuline et inhibe la polymérisation, est utilisé comme herbicide en raison de sa faible toxicité pour les cellules animales24.Contrairement au disopyramide, les benzamides apparentés ont des spécificités cibles différentes.En plus des microtubules végétaux, le RH-4032 ou le benzoxamide inhibe également les microtubules des cellules animales ou des oomycètes, respectivement, et le zalilamide est utilisé comme fongicide en raison de sa faible phytotoxicité25,26,27.L'ours nouvellement découvert et ses dérivés présentent une cytotoxicité sélective contre les plantes, mais il convient de noter que d'autres modifications pourraient modifier leur spécificité cible, fournissant potentiellement des dérivés supplémentaires pour le contrôle des champignons pathogènes ou des oomycètes.
Les propriétés uniques de l’acide urbénique et de ses dérivés sont utiles pour leur développement comme herbicides et leur utilisation comme outils de recherche.L’importance du cytosquelette dans le contrôle de la forme des cellules végétales est largement reconnue.Des études antérieures ont montré que les plantes ont développé des mécanismes complexes d'organisation des microtubules corticaux en contrôlant la dynamique des microtubules afin de contrôler correctement la morphogenèse.Un grand nombre de molécules responsables de la régulation de l'activité des microtubules ont été identifiées et des recherches connexes sont toujours en cours3,4,28.Notre compréhension actuelle de la dynamique des microtubules dans les cellules végétales n’explique pas entièrement les mécanismes d’organisation des microtubules corticaux.Par exemple, bien que le disopyramide et l'oryzaline puissent dépolymériser les microtubules, le disopyramide provoque une grave distorsion des racines tandis que l'oryzaline a un effet relativement léger.De plus, les mutations de la tubuline, qui stabilise les microtubules, provoquent également une dextrorotation des racines, contrairement au paclitaxel, qui stabilise également la dynamique des microtubules.Par conséquent, l’étude et l’identification des cibles moléculaires de l’acide ursolique devraient fournir de nouvelles informations sur la régulation des microtubules corticaux végétaux.De même, de futures comparaisons entre des produits chimiques efficaces pour favoriser une croissance déformée, tels que le disopyramide, et des produits chimiques moins efficaces, tels que l'oryzaline ou l'acide kumamoteur, fourniront des indices sur la manière dont se produisent les distorsions de croissance.
D’un autre côté, les réarrangements cytosquelettiques liés à la défense constituent une autre possibilité pour expliquer la cytotoxicité de l’acide ursonique.L'infection d'un agent pathogène ou l'introduction d'un éliciteur dans les cellules végétales provoque parfois la destruction du cytosquelette et la mort cellulaire ultérieure29.Par exemple, il a été rapporté que la cryptoxanthine dérivée des oomycètes perturbe les microtubules et les filaments d'actine avant la mort des cellules du tabac, de la même manière que ce qui se produit avec le traitement KAND30,31.Les similitudes entre les réponses de défense et les réponses cellulaires induites par l’acide ursonique nous ont amenés à émettre l’hypothèse qu’elles déclenchent des processus cellulaires courants, bien qu’un effet plus rapide et plus fort de l’acide ursonique que de la cryptoxanthine soit évident.Cependant, des études ont montré que la rupture des filaments d’actine favorise la mort cellulaire spontanée, qui ne s’accompagne pas toujours d’une rupture des microtubules29.En outre, il reste à voir si l'agent pathogène ou l'éliciteur provoque une croissance racinaire déformée, comme le font les dérivés de l'acide ursonique.Ainsi, les connaissances moléculaires liant les réponses de défense et le cytosquelette constituent un problème intéressant à aborder.En exploitant la présence de composés de faible poids moléculaire liés à l’acide ursonique, ainsi que d’une gamme de dérivés de puissance variable, ils pourraient offrir la possibilité de cibler des mécanismes cellulaires inconnus.
Ensemble, la découverte et l'application de nouveaux composés modulant la dynamique des microtubules fourniront des méthodes puissantes pour aborder les mécanismes moléculaires complexes qui sous-tendent la détermination de la forme des cellules végétales.Dans ce contexte, l’acide urmotonique, un composé récemment développé, qui affecte les microtubules et les filaments d’actine et induit la mort cellulaire, pourrait offrir l’occasion de déchiffrer le lien entre le contrôle des microtubules et ces autres mécanismes.Ainsi, les analyses chimiques et biologiques utilisant l’acide urbénique nous aideront à comprendre les mécanismes de régulation moléculaire qui contrôlent le cytosquelette végétal.
Inoculer S. werraensis MK493-CF1 dans un flacon Erlenmeyer à chicanes de 500 mL contenant 110 mL de milieu de semence composé de 2 % (p/v) de galactose, 2 % (p/v) de pâte d'essence, 1 % (p/v) de composition Bacto .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5 % (p/v) d'extrait de maïs (KOGOSTCH Co., Ltd., Japon), 0,2 % (p/v) (NH4)2SO4 et 0,2 % de CaCO3 dans de l'eau déminéralisée.(pH 7,4 avant stérilisation).Les cultures de graines ont été incubées sur un agitateur rotatif (180 tr/min) à 27°C pendant 2 jours.Culture de production par fermentation à l’état solide.La culture de graines (7 ml) a été transférée dans un flacon K-1 de 500 ml contenant 40 g de milieu de production constitué de 15 g d'orge pressée (MUSO Co., Ltd., Japon) et 25 g d'eau déionisée (pH non ajusté avant stérilisation) .).La fermentation a été réalisée à 30°C à l'obscurité pendant 14 jours.Le matériau de fermentation a été extrait avec 40 ml/bouteille d'EtOH et centrifugé (1 500 g, 4°C, 10 min).Le surnageant de culture (60 ml) a été extrait avec un mélange de MeOH/EtOAc à 10 %.La couche organique a été évaporée sous pression réduite pour obtenir un résidu (59,5 mg), qui a été soumis à une HPLC avec élution en gradient (0 à 10 minutes : 90 %) sur une colonne à phase inverse (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 µm, ID 10 mm × longueur 250 mm) H2O/CH3CN, 10 à 35 minutes : 90 % H2O/CH3CN à 70 % H2O/CH3CN (gradient), 35 à 45 minutes : 90 % H2O/EtOH, 45 à 155 minutes : 90 % H2O /EtOH à 100 % d'EtOH (gradient (gradient), 155 à 200 min : 100 % d'EtOH) à un débit de 1,5 ml/min, le coumamonamide (1, 36,0 mg) a été isolé sous forme de poudre amorphe blanche.
Kumamotoamide(1);1H-RMN (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H).), 4,08 (s, 3H);RMN 13C (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3 ;ESI-HRMS [M+H]+ : [C6H9N2O2]+ valeur calculée : 141,0659, valeur mesurée : 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Les graines de Columbia (Col-0) ont été obtenues auprès du Centre de ressources biologiques Arabidopsis (ABRC) avec autorisation à des fins de recherche.Les graines Col-0 ont été multipliées et entretenues dans nos conditions de laboratoire et utilisées comme plantes Arabidopsis de type sauvage.Les graines d'Arabidopsis ont été stérilisées en surface et cultivées dans un milieu Murashige et Skoog à moitié concentré contenant 2 % de saccharose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05 % (p/v) d'acide 2-(4-morpholino)éthanesulfonique (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical ).) et 1,5 % d'agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, à 23 °C et lumière constante.Les graines du mutant phs1-1 ont été fournies par T. Hashimoto (Institut des sciences et technologies de Nara).
Les graines de la souche SR-1 ont été fournies par T. Hashimoto (Institut des sciences et technologies de Nara) et utilisées comme plants de tabac de type sauvage.Les graines de tabac ont été stérilisées en surface et trempées dans de l'eau stérile pendant trois nuits pour favoriser la germination, puis placées dans une solution à moitié concentrée contenant 2 % de saccharose, 0,05 % (p/v) de MES et 0,8 % de gomme gellane (Fujifilm Wako Pure Chemical). Murashige.et milieu Skoog) avec un pH de 5,7 et incubé à 23°C sous lumière constante.
La souche Tak-1 a été fournie par T. Kohchi (Université de Kyoto) et a été utilisée comme unité expérimentale standard pour l'étude sur l'hépatique.Gemma a été obtenu à partir de plantes cultivées stérilisées, puis étalé sur du milieu Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) contenant 1% de saccharose et 0,3% de gomme gellane et incubé à 23 ° C sous une lumière continue.
Les cellules de tabac BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) ont été fournies par S. Hasezawa (Université de Tokyo).Les cellules BY-2 ont été diluées 95 fois dans un milieu de Linsmeier et Skoog modifié et complétées chaque semaine avec de l'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique 32 .La suspension cellulaire a été mélangée sur un agitateur rotatif à 130 tr/min à 27°C dans l'obscurité.Laver les cellules avec 10 fois le volume de milieu frais et remettre en suspension dans le même milieu.Des lignées cellulaires transgéniques BY-2 exprimant de manière stable le marqueur de microtubules TagRFP-TUA6 ou le marqueur de filament d'actine GFP-ABD2 sous le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur ont été générées comme décrit .Ces lignées cellulaires peuvent être entretenues et synchronisées à l’aide de procédures similaires à celles utilisées pour la lignée cellulaire BY-2 originale.
Les cellules HeLa ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) additionné de 10 % de sérum de veau fœtal, 1,2 U/ml de pénicilline et 1,2 µg/ml de streptomycine dans un incubateur à 37°C avec 5 % de CO2.
Toutes les expériences décrites dans ce manuscrit ont été réalisées conformément aux réglementations et directives japonaises en matière de biosécurité.
Les composés ont été dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) sous forme de solutions mères et dilués dans du milieu MS pour Arabidopsis et le tabac ou dans du milieu Gamborg B5 pour l'hépatique.Pour le test d'inhibition de la croissance des racines, plus de 10 graines par plaque ont été semées sur un milieu gélosé contenant les composés indiqués ou du DMSO.Les graines ont été incubées dans une chambre de croissance pendant 7 jours.Les plants ont été photographiés et la longueur des racines a été mesurée.Pour le test de germination d'Arabidopsis, 48 graines par plaque ont été semées sur un milieu gélose contenant 200 µM de composé ou de DMSO.Les graines d'Arabidopsis ont été cultivées dans une chambre de croissance et le nombre de plants germés a été compté 7 jours après la germination (jour).Pour le test de germination du tabac, 24 graines par boîte ont été semées sur un milieu gélosé contenant 200 µM de KAND ou de DMSO.Les graines de tabac ont été cultivées dans une chambre de croissance et le nombre de plants germés a été compté après 14 jours.Pour le test d'inhibition de la croissance de l'hépatique, 9 embryons de chaque boîte ont été étalés sur un milieu gélosé contenant les concentrations indiquées de KAND ou de DMSO et incubés dans une chambre de croissance pendant 14 jours.
Utilisez des plants tachés avec 5 mg/ml d’iodure de propidium (PI) pour visualiser l’organisation du méristème racinaire.Les signaux PI ont été observés par microscopie à fluorescence à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser TCS SPE (Leica Microsystems).
La coloration histochimique des racines avec la β-glucuronidase (GUS) a été réalisée selon le protocole décrit par Malami et Benfey36.Les plantules ont été fixées dans de l'acétone à 90 % pendant une nuit, colorées avec 0,5 mg/ml d'acide 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronique dans un tampon GUS pendant 1 heure et placées dans une solution de chloraldéhyde hydratée.(8 g d'hydrate de chloral, 2 ml d'eau et 1 ml de glycérol) et observés par microscopie à contraste interférentiel différentiel à l'aide d'un microscope Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Les angles des racines ont été mesurés sur des plants âgés de 7 jours cultivés sur des plaques placées verticalement.Mesurez l’angle de la racine par rapport à la direction du vecteur de gravité comme décrit à l’étape 6.
La disposition des microtubules corticaux a été observée comme décrit, avec des modifications mineures au protocole 37.Des anticorps anti-β-tubuline (KMX-1, Merk Millipore : MAB3408) et des IgG anti-souris conjuguées à Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific : A32723) ont été utilisés comme anticorps primaires et secondaires à des dilutions de 1 : 1000 et 1 : 100, respectivement.Les images de fluorescence ont été acquises à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser TCS SPE (Leica Microsystems).Acquérez des images Z-stack et créez des projections d’intensité maximale selon les instructions du fabricant.
Le test de prolifération cellulaire HeLa a été réalisé à l'aide du kit de comptage cellulaire 8 (Dojindo) conformément aux instructions du fabricant.
La croissance d'E. coli DH5α a été analysée en mesurant la densité cellulaire en culture à l'aide d'un spectrophotomètre à 600 nm (DO600).
L'organisation du cytosquelette dans les cellules transgéniques BY-2 a été observée à l'aide d'un microscope à fluorescence équipé d'un dispositif de balayage confocal CSU-X1 (Yokogawa) et d'une caméra sCMOS (Zyla, Andor Technology).La densité du cytosquelette a été évaluée par analyse d'image, qui a quantifié le pourcentage de pixels cytosquelettiques parmi les pixels cytoplasmiques dans les images confocales à l'aide du logiciel ImageJ comme décrit .
Pour détecter la mort cellulaire dans les cellules BY-2, une aliquote de la suspension cellulaire a été incubée avec 0,05 % de bleu Evans pendant 10 minutes à température ambiante.La coloration sélective au bleu Evans des cellules mortes dépend de l’extrusion du colorant des cellules viables par la membrane plasmique intacte40.Les cellules colorées ont été observées à l'aide d'un microscope à fond clair (BX53, Olympus).
Les cellules HeLa ont été cultivées dans du DMEM additionné de 10 % de FBS dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2.Les cellules ont été traitées avec 100 μM de KAND 11, de l'acide kumamonamique 6, du kumamonamide 1, 100 ng/ml de colcémide (Gibco) ou 100 ng/ml de Nocodmaze (Sigma) pendant 6 h à 37°C.Les cellules ont été fixées avec du MetOH pendant 10 min puis avec de l'acétate pendant 5 min à température ambiante.Les cellules fixées ont été incubées avec l'anticorps primaire β-tubuline (1D4A4, Proteintech : 66240-1) dilué dans 0,5 % de BSA/PBS pendant 2 heures, lavées 3 fois avec du TBST, puis incubées avec l'anticorps de chèvre Alexa Fluor.488 1 heure.– IgG de souris (Thermo Fisher Scientific : A11001) et 15 ng/ml de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dilué dans 0,5% BSA/PBS.Après trois lavages avec du TBST, les cellules colorées ont été observées sur un microscope inversé Nikon Eclipse Ti-E.Les images ont été capturées avec une caméra CCD Hamamatsu ORCA-R2 refroidie à l'aide du logiciel MetaMorph (Molecular Devices).
Heure de publication : 17 juin 2024