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La découverte et l'utilisation bénéfique des produits naturels peuvent contribuer à améliorer la vie humaine. Les inhibiteurs de croissance végétale sont largement utilisés comme herbicides pour lutter contre les mauvaises herbes. Face à la nécessité d'utiliser différents types d'herbicides, il est essentiel d'identifier des composés présentant de nouveaux mécanismes d'action. Dans cette étude, nous avons découvert un nouveau composé N-alcoxypyrrole, le coumamonamide, issu de Streptomyces werraensis MK493-CF1 et avons établi son processus de synthèse complet. Grâce à des tests d'activité biologique, nous avons découvert que l'acide urs-monoamique est un intermédiaire de synthèse de l'urs-monoamide et un composé potentiellement prometteur.inhibiteur de croissance végétaleDe plus, nous avons développé divers dérivés de l'acide urbénique, notamment le dérivé urbényloxy (UDA), qui présente une forte activité herbicide sans affecter négativement la croissance des cellules HeLa. Nous avons également constaté que les dérivés de l'acide urmotonique perturbent les microtubules végétaux ; par ailleurs, le KAND affecte les filaments d'actine et induit la mort cellulaire. Ces effets multiples diffèrent de ceux des inhibiteurs de microtubules connus et suggèrent un nouveau mécanisme d'action pour l'acide ursonique, ce qui représente un atout majeur pour le développement de nouveaux herbicides.
La découverte et l'application pratique de produits naturels bénéfiques et de leurs dérivés contribuent à améliorer la qualité de vie. Les métabolites secondaires produits par les micro-organismes, les plantes et les insectes ont permis des avancées majeures en médecine et en agriculture. De nombreux antibiotiques et médicaments antileucémiques ont été développés à partir de produits naturels. De plus, divers types depesticidesDes fongicides et des herbicides sont extraits de ces produits naturels pour être utilisés en agriculture. En particulier, les herbicides de désherbage sont des outils importants pour accroître les rendements agricoles en agriculture moderne, et divers types de composés sont déjà commercialisés. Plusieurs processus cellulaires chez les plantes, tels que la photosynthèse, le métabolisme des acides aminés, la synthèse de la paroi cellulaire, la régulation de la mitose, la signalisation phytohormonale ou la synthèse protéique, sont considérés comme des cibles typiques des herbicides. Les composés qui inhibent la fonction des microtubules constituent une classe courante d'herbicides qui affectent la croissance des plantes en agissant sur la régulation mitotique².
Les microtubules sont des composants du cytosquelette et sont largement conservés dans les cellules eucaryotes. L'hétérodimère de tubuline est constitué d'α-tubuline et de β-tubuline formant des protofilaments microtubulaires linéaires, dont 13 forment une structure cylindrique. Les microtubules jouent de multiples rôles dans les cellules végétales, notamment la détermination de la forme cellulaire, la division cellulaire et le transport intracellulaire3,4. Les cellules végétales contiennent des microtubules sous la membrane plasmique interphasique, et ces microtubules, dits corticaux, contrôleraient l'organisation des microfibrilles de cellulose par la régulation des complexes de cellulose synthase4,5. Les microtubules corticaux des cellules épidermiques racinaires, présents dans la zone d'élongation rapide de l'apex racinaire, sont situés latéralement. Les microfibres de cellulose suivent ces microtubules et limitent la direction de l'expansion cellulaire, favorisant ainsi une élongation cellulaire anisotrope. Par conséquent, la fonction des microtubules est étroitement liée à la morphologie végétale. Les substitutions d'acides aminés dans les gènes codant pour la tubuline induisent une asymétrie des réseaux de microtubules corticaux et une croissance oblique gauche-droite chez Arabidopsis 6,7. De même, des mutations dans les protéines associées aux microtubules, qui régulent leur dynamique, peuvent également entraîner une croissance racinaire anormale8,9,10,11,12,13. Par ailleurs, le traitement avec des herbicides perturbant les microtubules, tels que le disopyramide (ou prétilachlore), provoque également une croissance racinaire oblique gauche-droite14. Ces données indiquent que la régulation précise de la fonction des microtubules est essentielle pour déterminer la direction de la croissance des plantes.
Divers types d'inhibiteurs de microtubules ont été découverts et ces molécules ont apporté des contributions importantes à la recherche sur le cytosquelette, ainsi qu'à l'agriculture et à la médecine². En particulier, l'oryzaline, les composés de dinitroaniline, le disopyramide, les composés apparentés au benzamide et leurs analogues peuvent inhiber la fonction des microtubules et, par conséquent, la croissance des plantes. Ils sont donc largement utilisés comme herbicides. Cependant, les microtubules étant un composant essentiel des cellules végétales et animales, la plupart des inhibiteurs de microtubules sont cytotoxiques pour les deux types cellulaires. Par conséquent, malgré leur utilité reconnue comme herbicides, un nombre limité d'agents antimicrotubules sont utilisés en pratique.
Streptomyces est un genre de la famille des Streptomyces, qui comprend des bactéries aérobies, Gram-positives et filamenteuses, reconnues pour leur capacité à produire une large gamme de métabolites secondaires. De ce fait, elles sont considérées comme une source majeure de nouveaux produits naturels bioactifs. Dans cette étude, nous avons découvert un nouveau composé, le coumamonamide, isolé de Streptomyces werraensis MK493-CF1 et S. werraensis ISP 5486. L'analyse spectrale et l'analyse spectrale complète ont permis de caractériser la structure du coumamonamide et de déterminer son squelette unique de N-alcoxypyrrole. L'acide ursmonique, un intermédiaire de synthèse du coumamonamide et de ses dérivés, inhibe la croissance et la germination de la plante modèle Arabidopsis thaliana. Une étude de la relation structure-activité a révélé qu'un composé dont le carbone C9 est modifié en acide ursonique, appelé dérivé nonyloxy de l'acide ursonique (KAND), renforce significativement l'effet inhibiteur sur la croissance et la germination. Notamment, ce nouvel inhibiteur de croissance végétale affecte également la croissance du tabac et de l'hépatique, sans être cytotoxique pour les bactéries ni les cellules HeLa. De plus, certains dérivés de l'acide urmotonique induisent un phénotype racinaire anormal, suggérant une action directe ou indirecte sur les microtubules. Conformément à cette hypothèse, nos observations de microtubules marqués par immunohistochimie ou par des protéines fluorescentes indiquent que le traitement par KAND dépolymérise les microtubules. Par ailleurs, ce traitement perturbe les microfilaments d'actine. Ainsi, nous avons découvert un nouvel inhibiteur de croissance végétale dont le mécanisme d'action unique repose sur la destruction du cytosquelette.
La souche MK493-CF1 a été isolée d'un sol de l'arrondissement de Shinagawa à Tokyo. Cette souche présente un mycélium stromal bien ramifié. La séquence partielle du gène de l'ARN ribosomique 16S (1422 pb) a été déterminée. Cette souche est très similaire à *S. werraensis* (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 pb, T : souche type, 99,93 %). Ce résultat a permis de conclure à une forte parenté avec la souche type de *S. werraensis*. Par conséquent, nous l'avons provisoirement nommée *S. werraensis* MK493-CF1. *S. werraensis* ISP 5486T produit également les mêmes composés bioactifs. Compte tenu du peu d'études antérieures sur l'obtention de produits naturels à partir de ce micro-organisme, des recherches chimiques complémentaires ont été menées. Après culture de S. werraensis MK493-CF1 sur milieu d'orge par fermentation en milieu solide à 30 °C pendant 14 jours, le milieu a été extrait avec de l'éthanol à 50 %. 60 ml d'échantillon ont été séchés pour obtenir 59,5 mg d'extrait brut. Cet extrait brut a été purifié par HPLC en phase inverse, ce qui a permis d'isoler le N-méthoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, nommé coumamotoamide, 36,0 mg). La quantité totale de 1 représente environ 60 % de l'extrait brut. Par conséquent, nous avons décidé d'étudier plus en détail les propriétés du coumamotoamide 1.
La coumamonamide 1 se présente sous forme de poudre amorphe blanche. Sa formule brute, C₆H₈N₂O₂, est confirmée par spectrométrie de masse à haute résolution (HRESIMS) (Fig. 1). Le fragment pyrrole substitué en C2 est caractérisé par les signaux RMN ¹H à 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, δH dans le spectre RMN ¹H : 4,5 Hz, H-5) et 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6). Le spectre RMN ¹³C révèle la présence de quatre atomes de carbone sp². La présence d'un groupe amide en position C2 a été mise en évidence par corrélation HMBC entre le proton en C-3 et le carbone carbonyle de l'amide à δC = 161,1. De plus, les pics RMN ¹H et ¹³C à δH 4,10 (3H, S) et δC 68,3 indiquent la présence de groupements N-méthoxy dans la molécule. Bien que la position exacte du groupement méthoxy n'ait pas encore été déterminée par analyse spectroscopique, notamment par spectroscopie de différence améliorée et par NOEDF (spectroscopie d'Overhauser nucléaire), le N-méthoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide a été le premier composé candidat.
Pour déterminer la structure correcte de 1, une synthèse totale a été réalisée (Fig. 2a). Le traitement de la 2-aminopyridine 2, disponible dans le commerce, avec du m-CPBA a conduit au N-oxyde correspondant 3 avec un rendement quantitatif. Après 2-aminoazidation de 2, la réaction de cyclocondensation décrite par Abramovich a été effectuée dans le benzène à 90 °C pour obtenir le 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 souhaité, avec un rendement de 60 % (en deux étapes).15,16 La méthylation et l'hydrolyse de 4 ont ensuite donné l'acide 1-méthoxy-1H-pyrrole-2-carboxylique (appelé « acide cumotonique », 6) avec un bon rendement (70 %, en deux étapes). Enfin, l'amidation via le chlorure d'acide intermédiaire 6, en utilisant de l'ammoniaque aqueuse, a conduit à l'amide de Kumamoto 1 avec un rendement de 98 %. Toutes les données spectrales de 1 synthétisé étaient similaires à celles de 1 isolé, ce qui a permis de déterminer la structure de 1.
Synthèse générale et analyse de l'activité biologique de l'urbénamide et de l'acide urbénique. (a) Synthèse totale de l'amide de Kumamoto. (b) Des plantules d'Arabidopsis Columbia (Col) de type sauvage âgées de sept jours ont été cultivées sur milieu Murashige et Skoog (MS) contenant du coumamonamide 6 ou du coumamonamide 1 aux concentrations indiquées. Échelle : 1 cm.
Nous avons d'abord évalué les activités biologiques de l'urbénamide et de ses intermédiaires quant à leur capacité à moduler la croissance des plantes. Nous avons ajouté différentes concentrations d'ursmonamide 1 ou d'acide ursmonique 6 à un milieu gélosé MS et cultivé des plantules d'Arabidopsis thaliana sur ce milieu. Ces essais ont montré que des concentrations élevées (500 μM) de 6 inhibaient la croissance racinaire (Fig. 2b). Ensuite, nous avons synthétisé différents dérivés en substituant l'azote en position N1 de 6 et réalisé des études de relations structure-activité (le processus de synthèse des analogues est décrit dans les informations supplémentaires). Des plantules d'Arabidopsis ont été cultivées sur un milieu contenant 50 μM de dérivés d'acide ursonique, et la longueur de leurs racines a été mesurée, comme illustré sur la figure. Comme le montrent les figures 3a, b et S1, les acides coumamo présentent des chaînes alcoxy linéaires de différentes longueurs (9, 10, 11, 12 et 13) ou de longues chaînes alcoxy (15, 16 et 17) en position N1. Les dérivés ont montré une inhibition significative de la croissance racinaire. De plus, nous avons constaté que l'application de 200 μM des dérivés 10, 11 ou 17 inhibait la germination (figures 3c et S2).
Étude de la relation structure-activité de l'amide de Kumamoto et de composés apparentés. (a) Structure et schéma de synthèse des analogues. (b) Quantification de la longueur des racines de plantules âgées de 7 jours cultivées sur milieu MS avec ou sans 50 μM de dérivés de coumamonamide. Les astérisques indiquent des différences significatives par rapport au traitement témoin (test t, p < 0,05).< 0,05). n>18. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type. « nt » signifie « non testé » car plus de 50 % des graines n’ont pas germé. (c) Quantification du taux de germination des graines traitées incubées pendant 7 jours dans un milieu MS avec ou sans 200 µM de coumamonamide et de composés apparentés. Les astérisques indiquent des différences significatives par rapport au traitement témoin (test du χ²). n = 96.
Il est intéressant de noter que l'ajout de chaînes latérales alkyles plus longues que C9 a réduit l'activité inhibitrice, suggérant que les composés apparentés à l'acide kumamotoïque nécessitent des chaînes latérales d'une certaine taille pour présenter leur activité biologique.
L'analyse des relations structure-activité ayant montré que le C9 était modifié en acide ursonique et que le dérivé nonyloxy de cet acide (désigné ci-après par KAND 11) était l'inhibiteur de croissance végétale le plus efficace, nous avons procédé à une caractérisation plus détaillée de KAND 11. Le traitement d'Arabidopsis avec 50 μM de KAND 11 a quasiment inhibé la germination, tandis que des concentrations plus faibles (40, 30, 20 ou 10 μM) de KAND 11 ont inhibé la croissance racinaire de manière dose-dépendante (Fig. 4a, b). Afin de déterminer si KAND 11 affecte la viabilité des méristèmes racinaires, nous avons examiné des méristèmes racinaires colorés au bromure de propidium (PI) et mesuré leur surface. La taille du méristème des plantules cultivées sur un milieu contenant 25 μM de KAND-11 était de 151,1 ± 32,5 μm, tandis que celle du méristème des plantules cultivées sur un milieu témoin contenant du DMSO était de 264,7 ± 30,8 μm (Fig. 4c, d), ce qui indique que le KAND-11 restaure l'activité cellulaire et favorise l'étalement du méristème racinaire. De même, le traitement au KAND-11 a réduit l'intensité du signal du marqueur de division cellulaire CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS dans le méristème racinaire (Fig. 4e)17. Ces résultats indiquent que le KAND-11 inhibe la croissance racinaire en réduisant l'activité de prolifération cellulaire.
Analyse de l'effet inhibiteur des dérivés de l'acide urbénique (dérivés urbényloxy) sur la croissance. (a) Plantules de Col de type sauvage âgées de 7 jours, cultivées sur milieu MS avec les concentrations indiquées de KAND 11. Échelle : 1 cm. (b) Quantification de la longueur des racines. Les lettres indiquent des différences significatives (test HSD de Tukey, p < 0,05).< 0,05). n>16. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type. (c) Microscopie confocale de racines de Col de type sauvage colorées au iodure de propidium, cultivées sur milieu MS avec ou sans 25 µM de KAND 11. Les crochets blancs indiquent le méristème racinaire. Échelle : 100 µm. (d) Quantification de la taille du méristème racinaire (n = 10 à 11). Les différences statistiques ont été déterminées par un test t (p < 0,05).< 0,05). Les barres représentent la taille moyenne du méristème. (e) Microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC) d'un méristème racinaire contenant la construction CDKB2 ; 1pro : CDKB2 ; 1-GUS coloré et coloré sur des plantules de 5 jours cultivées sur des plaques MS avec ou sans dosage KAND 25 µM.
La phytotoxicité du KAND 11 a été testée plus en détail sur une autre plante dicotylédone, le tabac (Nicotiana tabacum), et sur un organisme modèle terrestre important, la marche polymorphe (Marchantia polymorpha). Comme chez Arabidopsis, les plantules de tabac SR-1 cultivées sur un milieu contenant 25 μM de KAND 11 ont développé des racines plus courtes (Fig. 5a). De plus, 40 des 48 graines ont germé sur des plaques contenant 200 μM de KAND 11, tandis que les 48 graines ont germé sur les milieux témoins, indiquant que des concentrations plus élevées de KAND étaient significatives (p < 0,05).< 0,05 ; test du χ²) a inhibé la germination du tabac (Fig. 5b). De plus, la concentration de KAND 11 inhibant la croissance bactérienne chez l’hépatique était similaire à la concentration efficace chez Arabidopsis (Fig. 5c). Ces résultats indiquent que KAND 11 peut inhiber la croissance de diverses plantes. Nous avons ensuite étudié la cytotoxicité potentielle de composés apparentés aux monoamides d’ours sur d’autres organismes, à savoir les cellules humaines HeLa et la souche DH5α d’Escherichia coli, représentatives respectivement des cellules animales supérieures et bactériennes. Dans une série de tests de prolifération cellulaire, nous avons observé que le coumamonamide 1, l’acide coumamonamidique 6 et le KAND 11 n’affectaient pas la croissance des cellules HeLa ou d’E. coli à une concentration de 100 µM (Fig. 5d,e).
Inhibition de la croissance par KAND 11 chez des organismes autres qu'Arabidopsis. (a) Des plantules de tabac SR-1 de type sauvage âgées de deux semaines ont été cultivées sur des plaques MS disposées verticalement et contenant 25 μM de KAND 11. (b) Des plantules de tabac SR-1 de type sauvage âgées de deux semaines ont été cultivées sur des plaques MS disposées horizontalement et contenant 200 μM de KAND 11. (c) Des bourgeons d'hépatique Tak-1 de type sauvage âgés de deux semaines ont été cultivés sur des plaques Gamborg B5 avec les concentrations indiquées de KAND 11. Les flèches rouges indiquent les spores dont la croissance s'est arrêtée au cours des deux semaines d'incubation. (d) Test de prolifération cellulaire sur des cellules HeLa. Le nombre de cellules viables a été mesuré à intervalles de temps réguliers à l'aide d'un kit de comptage cellulaire 8 (Dojindo). En tant que témoin, des cellules HeLa ont été traitées avec 5 μg/ml d'actinomycine D (Act D), qui inhibe la transcription de l'ARN polymérase et induit la mort cellulaire. Les analyses ont été réalisées en triplicata. e) Test de prolifération cellulaire d’E. coli. La croissance d’E. coli a été analysée par mesure de la DO600. En tant que témoin, les cellules ont été traitées avec 50 μg/ml d’ampicilline (Amp), un inhibiteur de la synthèse de la paroi cellulaire bactérienne. Les analyses ont été réalisées en triplicata.
Afin de décrypter le mécanisme d'action de la cytotoxicité induite par les composés apparentés à l'uramide, nous avons réanalysé des dérivés de l'acide urbénique présentant des effets inhibiteurs modérés, comme illustré sur la figure. Comme le montrent les figures 2b et 6a, les plantules cultivées sur des plaques d'agar contenant une forte concentration (200 μM) d'acide urmotonique 6 ont développé des racines plus courtes et incurvées vers la gauche (θ = – 23,7 ± 6,1°), tandis que celles cultivées sur le milieu témoin ont développé des racines presque droites (θ = – 3,8 ± 7,1°). Cette croissance oblique caractéristique est connue pour résulter d'un dysfonctionnement des microtubules corticaux14,18. Conformément à cette observation, les médicaments déstabilisateurs de microtubules que sont le disopyramide et l'oryzaline ont induit une inclinaison racinaire similaire dans nos conditions de culture (figures 2b et 6a). Parallèlement, nous avons testé des dérivés de l'acide urmotonique et sélectionné plusieurs d'entre eux qui, à certaines concentrations, induisaient une croissance racinaire oblique. Les composés 8, 9 et 15 ont modifié la direction de la croissance racinaire à des concentrations respectives de 75 µM, 50 µM et 40 µM, indiquant leur capacité à déstabiliser efficacement les microtubules (Fig. 2b, 6a). Nous avons également testé le dérivé d'acide ursolique le plus puissant, le KAND 11, à une concentration plus faible (15 µM) et constaté que son application inhibait la croissance racinaire et que celle-ci était irrégulière, bien que tendant à s'incliner vers la gauche (Figure C3). Étant donné que des concentrations plus élevées de substances déstabilisant les microtubules inhibent parfois la croissance des plantes plutôt que de provoquer une inclinaison racinaire, nous avons ensuite examiné l'hypothèse selon laquelle le KAND 11 affecterait les microtubules en observant les microtubules corticaux dans les cellules épidermiques racinaires. L'immunohistochimie réalisée avec des anticorps anti-β-tubuline sur des cellules épidermiques de racines de plantules traitées avec 25 μM de KAND 11 a révélé la disparition de la quasi-totalité des microtubules corticaux dans les cellules épidermiques de la zone d'élongation (Fig. 6b). Ces résultats indiquent que l'acide kumamotonique et ses dérivés agissent directement ou indirectement sur les microtubules pour les perturber et que ces composés sont de nouveaux inhibiteurs de microtubules.
L'acide urmotonique et ses dérivés modifient les microtubules corticaux chez Arabidopsis thaliana. (a) Angle d'inclinaison racinaire mesuré en présence de différents dérivés de l'acide urmotonique aux concentrations indiquées. Les effets de deux composés connus pour inhiber les microtubules, le disopyramide et l'oryzaline, ont également été analysés. L'encart montre l'étalon utilisé pour mesurer l'angle de croissance racinaire. Les astérisques indiquent des différences significatives par rapport au traitement témoin (test t, p < 0,05).< 0,05). n>19. Échelle = 1 cm. (b) Microtubules corticaux dans les cellules épidermiques de la zone d'élongation. Les microtubules des racines d'Arabidopsis Col de type sauvage, cultivées sur milieu MS avec ou sans 25 µM de KAND 11, ont été visualisés par immunohistochimie à l'aide d'anticorps primaires anti-β-tubuline et d'anticorps secondaires conjugués à l'Alexa Fluor. Échelle = 10 µm. (c) Structure mitotique des microtubules dans le méristème racinaire. Les microtubules ont été visualisés par immunohistochimie. Les structures mitotiques, incluant les zones prophasiques, les fuseaux et les phragmoplastes, ont été comptées à partir d'images confocales. Les flèches indiquent les structures microtubulaires mitotiques. Les astérisques indiquent des différences significatives par rapport au traitement témoin (test t, p < 0,05).< 0,05). n>9. Barre d'échelle = 50 µm.
Bien qu'Ursa soit capable de perturber la fonction des microtubules, son mécanisme d'action devrait différer de celui des agents dépolymérisants de microtubules classiques. Par exemple, des concentrations élevées d'agents dépolymérisants de microtubules tels que le disopyramide et l'oryzaline induisent une expansion anisotrope des cellules épidermiques, contrairement à KAND 11. De plus, la co-application de KAND 11 et de disopyramide a entraîné une réponse combinée de croissance racinaire induite par le disopyramide et une inhibition de croissance induite par KAND 11 (Fig. S4). Nous avons également analysé la réponse du mutant hypersensible disopyramide 1-1 (phs1-1) au KAND 11. phs1-1 présente une mutation ponctuelle non canonique de la tubuline kinase et développe des racines plus courtes lorsqu'il est traité au disopyramide9,20. Les plantules mutantes phs1-1 cultivées sur un milieu gélosé contenant du KAND 11 présentaient des racines plus courtes, similaires à celles cultivées sur disopyramide (fig. S5).
De plus, nous avons observé des structures de microtubules mitotiques, telles que des zones de prophase, des fuseaux et des phragmoplastes, dans le méristème racinaire des plantules traitées avec KAND 11. Conformément aux observations pour CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, une diminution significative du nombre de microtubules mitotiques a été observée (Fig. .6c).
Afin de caractériser la cytotoxicité du KAND 11 à l'échelle subcellulaire, nous avons traité des cellules BY-2 de tabac en suspension avec ce composé et observé leur réponse. Nous avons d'abord ajouté du KAND 11 à des cellules BY-2 exprimant TagRFP-TUA6, un marqueur fluorescent des microtubules, afin d'évaluer son effet sur les microtubules corticaux. La densité des microtubules corticaux a été évaluée par analyse d'images, quantifiant le pourcentage de pixels cytosquelettiques parmi les pixels cytoplasmiques. Les résultats ont montré qu'après un traitement d'une heure avec 50 μM ou 100 μM de KAND 11, la densité diminuait significativement, atteignant respectivement 0,94 ± 0,74 % et 0,23 ± 0,28 %, tandis que la densité des cellules traitées avec du DMSO était de 1,61 ± 0,34 % (Fig. 7a). Ces résultats concordent avec l'observation faite chez Arabidopsis selon laquelle le traitement au KAND 11 induit la dépolymérisation des microtubules corticaux (Fig. 6b). Nous avons également examiné la lignée BY-2, dont les filaments d'actine étaient marqués par GFP-ABD, après traitement avec la même concentration de KAND 11 et observé que ce traitement perturbait les filaments d'actine. Un traitement de 1 h avec 50 μM ou 100 μM de KAND 11 a réduit significativement la densité des filaments d'actine à 1,20 ± 0,62 % et 0,61 ± 0,26 %, respectivement, tandis que la densité dans les cellules traitées au DMSO était de 1,69 ± 0,51 % (Fig. 2b). Ces résultats contrastent avec les effets du propyzamide, qui n'affecte pas les filaments d'actine, et de la latrunculine B, un dépolymérisateur d'actine qui n'affecte pas les microtubules (Figure S6 des informations supplémentaires). De plus, le traitement par le coumamonamide 1, l'acide coumamonamide 6 ou le KAND 11 n'a pas affecté les microtubules dans les cellules HeLa (Figure S7 des informations supplémentaires). Le mécanisme d'action du KAND 11 serait donc différent de celui des perturbateurs du cytosquelette connus. Par ailleurs, l'observation microscopique de cellules BY-2 traitées au KAND 11 a révélé l'apparition de la mort cellulaire au cours du traitement et a montré que la proportion de cellules mortes colorées au bleu d'Evans n'augmentait pas significativement après 30 minutes de traitement, tandis qu'après 90 minutes de traitement avec 50 μM ou 100 μM de KAND, le nombre de cellules mortes atteignait respectivement 43,7 % et 80,1 % (Figure 7c). L'ensemble de ces données indique que le nouveau dérivé de l'acide ursolique, le KAND 11, est un inhibiteur du cytosquelette spécifique aux plantes, doté d'un mécanisme d'action jusqu'alors inconnu.
Le KAND affecte les microtubules corticaux, les filaments d'actine et la viabilité des cellules BY-2 de tabac. (a) Visualisation des microtubules corticaux dans les cellules BY-2 en présence de TagRFP-TUA6. Les cellules BY-2 traitées avec du KAND 11 (50 μM ou 100 μM) ou du DMSO ont été examinées par microscopie confocale. La densité des microtubules corticaux a été calculée à partir des micrographies de 25 cellules indépendantes. Les lettres indiquent des différences significatives (test HSD de Tukey, p < 0,05).< 0,05). Échelle = 10 µm. (b) Filaments d'actine corticale dans les cellules BY-2 visualisés en présence de GFP-ABD2. Les cellules BY-2 traitées avec du KAND 11 (50 µM ou 100 µM) ou du DMSO ont été examinées par microscopie confocale. La densité des filaments d'actine corticale a été calculée à partir de micrographies de 25 cellules indépendantes. Les lettres indiquent des différences significatives (test HSD de Tukey, p < 0,05).< 0,05). Échelle = 10 µm. (c) Observation de cellules BY-2 mortes par coloration au bleu d'Evans. Les cellules BY-2 traitées avec du KAND 11 (50 µM ou 100 µM) ou du DMSO ont été examinées par microscopie en fond clair. n = 3. Échelle = 100 µm.
La découverte et l'application de nouveaux produits naturels ont permis des avancées significatives dans divers domaines de la vie humaine, notamment la médecine et l'agriculture. Des recherches historiques ont été menées pour obtenir des composés utiles à partir de ressources naturelles. En particulier, les actinomycètes sont reconnus pour leur activité antiparasitaire contre les nématodes, grâce à leur capacité à produire divers métabolites secondaires tels que l'avermectine, précurseur de l'ivermectine et de la bléomycine et de ses dérivés, utilisés en médecine comme agents anticancéreux21,22. De même, divers composés herbicides ont été découverts chez les actinomycètes, dont certains sont déjà commercialisés1,23. Par conséquent, l'analyse des métabolites d'actinomycètes pour isoler des produits naturels aux activités biologiques recherchées est considérée comme une stratégie efficace. Dans cette étude, nous avons découvert un nouveau composé, le coumamonamide, à partir de S. werraensis et l'avons synthétisé avec succès. L'acide ursonique est un intermédiaire de synthèse de l'urbénamide et de ses dérivés. Elle peut provoquer un enroulement caractéristique des racines, présenter une activité herbicide modérée à forte et endommager directement ou indirectement les microtubules des plantes. Cependant, le mécanisme d'action de l'acide urmotonique pourrait différer de celui des inhibiteurs de microtubules existants, puisque le KAND 11 perturbe également les filaments d'actine et provoque la mort cellulaire, ce qui suggère un mécanisme de régulation par lequel l'acide urmotonique et ses dérivés influencent un large éventail de structures cytosquelettiques.
Une caractérisation plus détaillée de l'acide ursonique permettra de mieux comprendre son mécanisme d'action. Plus précisément, l'objectif suivant est d'évaluer sa capacité à se lier aux microtubules réduits afin de déterminer si l'acide ursonique et ses dérivés agissent directement sur les microtubules en les dépolymérisant, ou si leur action entraîne leur déstabilisation. De plus, lorsque les microtubules ne constituent pas une cible directe, l'identification du site d'action et des cibles moléculaires de l'acide ursonique sur les cellules végétales contribuera à une meilleure compréhension des propriétés des composés apparentés et des pistes d'amélioration de l'activité herbicide. Notre test de bioactivité a révélé la cytotoxicité unique de l'acide ursonique sur la croissance de plantes telles qu'Arabidopsis thaliana, le tabac et l'hépatique, tandis que les cellules d'E. coli et de HeLa n'ont pas été affectées. La faible toxicité, voire l'absence de toxicité, pour les cellules animales est un avantage des dérivés de l'acide ursonique s'ils sont développés comme herbicides pour une utilisation en plein champ. En effet, les microtubules étant des structures communes aux eucaryotes, leur inhibition sélective chez les plantes est une condition essentielle pour les herbicides. Par exemple, le propyzamide, un agent dépolymérisant les microtubules qui se lie directement à la tubuline et inhibe sa polymérisation, est utilisé comme herbicide en raison de sa faible toxicité pour les cellules animales24. Contrairement au disopyramide, les benzamides apparentés présentent des spécificités de cible différentes. Outre les microtubules végétaux, le RH-4032 ou le benzoxamide inhibent également les microtubules des cellules animales ou des oomycètes, respectivement, et le zalilamide est utilisé comme fongicide en raison de sa faible phytotoxicité25,26,27. Le benzamide récemment découvert et ses dérivés présentent une cytotoxicité sélective envers les plantes, mais il convient de noter que des modifications supplémentaires pourraient altérer leur spécificité de cible, permettant potentiellement d'obtenir d'autres dérivés pour lutter contre les champignons ou les oomycètes pathogènes.
Les propriétés uniques de l'acide urbénique et de ses dérivés sont utiles pour leur développement en tant qu'herbicides et leur utilisation comme outils de recherche. L'importance du cytosquelette dans le contrôle de la forme des cellules végétales est largement reconnue. Des études antérieures ont montré que les plantes ont développé des mécanismes complexes d'organisation des microtubules corticaux en contrôlant leur dynamique afin de maîtriser la morphogenèse. De nombreuses molécules responsables de la régulation de l'activité des microtubules ont été identifiées, et les recherches dans ce domaine se poursuivent3,4,28. Notre compréhension actuelle de la dynamique des microtubules dans les cellules végétales n'explique pas entièrement les mécanismes d'organisation des microtubules corticaux. Par exemple, bien que le disopyramide et l'oryzaline puissent tous deux dépolymériser les microtubules, le disopyramide provoque une forte déformation des racines tandis que l'oryzaline a un effet relativement modéré. De plus, les mutations de la tubuline, qui stabilise les microtubules, induisent également une dextrorotation des racines, contrairement au paclitaxel, qui stabilise également la dynamique des microtubules. Par conséquent, l'étude et l'identification des cibles moléculaires de l'acide ursolique devraient apporter un éclairage nouveau sur la régulation des microtubules corticaux chez les plantes. De même, des comparaisons futures entre des substances chimiques efficaces pour induire une croissance anormale, comme le disopyramide, et des substances moins efficaces, comme l'oryzaline ou l'acide kumamotorique, permettront de mieux comprendre les mécanismes de cette croissance anormale.
Par ailleurs, les réarrangements du cytosquelette liés à la défense constituent une autre explication possible de la cytotoxicité de l'acide ursonique. L'infection par un pathogène ou l'introduction d'un éliciteur dans les cellules végétales provoquent parfois la destruction du cytosquelette et la mort cellulaire subséquente29. Par exemple, il a été rapporté que la cryptoxanthine, dérivée d'oomycètes, perturbe les microtubules et les filaments d'actine avant la mort des cellules de tabac, un phénomène similaire à celui observé avec le traitement au KAND30,31. Les similitudes entre les réponses de défense et les réponses cellulaires induites par l'acide ursonique nous ont amenés à formuler l'hypothèse qu'elles déclenchent des processus cellulaires communs, bien qu'un effet plus rapide et plus marqué de l'acide ursonique que de la cryptoxanthine soit manifeste. Cependant, des études ont montré que la perturbation des filaments d'actine favorise la mort cellulaire spontanée, qui n'est pas toujours accompagnée d'une perturbation des microtubules29. De plus, il reste à déterminer si le pathogène ou l'éliciteur provoque une croissance racinaire anormale, comme c'est le cas avec les dérivés de l'acide ursonique. Ainsi, la compréhension moléculaire des liens entre les réponses de défense et le cytosquelette représente un sujet d'étude prometteur. L'exploitation de composés de faible poids moléculaire apparentés à l'acide ursonique, ainsi que de divers dérivés aux activités variées, pourrait ouvrir la voie à l'exploration de mécanismes cellulaires encore inconnus.
La découverte et l'application de nouveaux composés modulant la dynamique des microtubules offriront des méthodes puissantes pour étudier les mécanismes moléculaires complexes qui déterminent la forme des cellules végétales. Dans ce contexte, l'acide urmotonique, un composé récemment développé qui agit sur les microtubules et les filaments d'actine et induit la mort cellulaire, pourrait permettre de décrypter le lien entre la régulation des microtubules et ces autres mécanismes. Ainsi, l'analyse chimique et biologique de l'acide urmotonique contribuera à notre compréhension des mécanismes de régulation moléculaire qui contrôlent le cytosquelette végétal.
Inoculer S. werraensis MK493-CF1 dans un erlenmeyer de 500 mL à chicanes contenant 110 mL de milieu de pré-culture composé de 2 % (p/v) de galactose, 2 % (p/v) de pâte Essence, 1 % (p/v) de soja (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5 % (p/v) d'extrait de maïs (KOGOSTCH Co., Ltd., Japon), 0,2 % (p/v) de (NH₄)₂SO₄ et 0,2 % de CaCO₃ dans de l'eau déminéralisée (pH 7,4 avant stérilisation). Les pré-cultures ont été incubées sous agitation rotative (180 tr/min) à 27 °C pendant 2 jours. Culture de production par fermentation en milieu solide. La culture de départ (7 ml) a été transférée dans un flacon K-1 de 500 ml contenant 40 g de milieu de production composé de 15 g d'orge pressée (MUSO Co., Ltd., Japon) et de 25 g d'eau déminéralisée (pH non ajusté avant stérilisation). La fermentation a été réalisée à 30 °C à l'obscurité pendant 14 jours. Le milieu de fermentation a été extrait avec 40 ml d'éthanol par flacon et centrifugé (1500 g, 4 °C, 10 min). Le surnageant de culture (60 ml) a été extrait avec un mélange méthanol/acétate d'éthyle (10/10). La phase organique a été évaporée sous pression réduite pour obtenir un résidu (59,5 mg), qui a été soumis à une HPLC avec élution en gradient (0–10 minutes : 90 %) sur une colonne à phase inverse (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × longueur 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minutes : 90 % H2O/CH3CN à 70 % H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minutes : 90 % H2O/EtOH, 45–155 minutes : 90 % H2O/EtOH à 100 % EtOH (gradient), 155–200 min : 100 % EtOH) à un débit de 1,5 ml/min, le coumamonamide (1, 36,0 mg) a été isolé sous forme de poudre amorphe blanche.
Kumamotoamide(1); 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz, 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H), 4,08 (s, 3H); 13C-RMN (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ valeur calculée : 141,0659, valeur mesurée : 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Les graines de Columbia (Col-0) ont été obtenues auprès de l'Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) avec l'autorisation d'être utilisées à des fins de recherche. Ces graines ont été propagées et maintenues dans nos conditions de laboratoire et utilisées comme plantes d'Arabidopsis de type sauvage. Les graines d'Arabidopsis ont été stérilisées en surface et cultivées dans un milieu de Murashige et Skoog à demi-concentration contenant 2 % de saccharose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05 % (p/v) d'acide 2-(4-morpholino)éthanesulfonique (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) et 1,5 % d'agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), à pH 5,7, à 23 °C et sous lumière constante. Les graines du mutant phs1-1 ont été fournies par T. Hashimoto (Institut des sciences et technologies de Nara).
Les semences de la souche SR-1 ont été fournies par T. Hashimoto (Institut des sciences et technologies de Nara) et utilisées comme plants de tabac de type sauvage. Les semences de tabac ont été stérilisées en surface et trempées dans de l'eau stérile pendant trois nuits pour favoriser la germination, puis placées dans une solution diluée de moitié contenant 2 % de saccharose, 0,05 % (p/v) de MES et 0,8 % de gomme gellane (Fujifilm Wako Pure Chemical) (milieu de Murashige et Skoog) à pH 5,7 et incubées à 23 °C sous lumière constante.
La souche Tak-1, fournie par T. Kohchi (Université de Kyoto), a servi d'unité expérimentale standard pour l'étude des hépatiques. Les gemmes ont été prélevées sur des plantes cultivées stérilisées, puis étalées sur milieu Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) contenant 1 % de saccharose et 0,3 % de gomme gellane et incubées à 23 °C sous lumière continue.
Les cellules BY-2 de tabac (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) ont été fournies par S. Hasezawa (Université de Tokyo). Ces cellules ont été diluées 95 fois dans un milieu de Linsmeier et Skoog modifié et supplémentées chaque semaine avec de l'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique32. La suspension cellulaire a été incubée sous agitation rotative à 130 tr/min à 27 °C à l'obscurité. Les cellules ont été lavées avec 10 fois leur volume de milieu frais, puis remises en suspension dans le même milieu. Des lignées cellulaires BY-2 transgéniques exprimant de manière stable le marqueur de microtubules TagRFP-TUA6 ou le marqueur de filaments d'actine GFP-ABD2 sous le contrôle du promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur ont été générées comme décrit précédemment33,34,35. Ces lignées cellulaires peuvent être maintenues et synchronisées selon des procédures similaires à celles utilisées pour la lignée cellulaire BY-2 originale.
Les cellules HeLa ont été cultivées dans du milieu de Dulbecco modifié (DMEM) (Life Technologies) supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal, 1,2 U/ml de pénicilline et 1,2 μg/ml de streptomycine dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2.
Toutes les expériences décrites dans ce manuscrit ont été réalisées conformément à la réglementation et aux directives japonaises en matière de biosécurité.
Les composés ont été dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO ; Fujifilm Wako Pure Chemical) pour obtenir des solutions mères, puis dilués dans du milieu MS pour Arabidopsis et le tabac, ou dans du milieu Gamborg B5 pour l'hépatique. Pour le test d'inhibition de la croissance racinaire, plus de 10 graines par boîte de Petri ont été semées sur un milieu gélosé contenant les composés indiqués ou du DMSO. Les graines ont été incubées en chambre de culture pendant 7 jours. Les plantules ont été photographiées et la longueur de leurs racines a été mesurée. Pour le test de germination d'Arabidopsis, 48 graines par boîte de Petri ont été semées sur un milieu gélosé contenant 200 μM de composé ou de DMSO. Les graines d'Arabidopsis ont été cultivées en chambre de culture et le nombre de plantules germées a été compté 7 jours après la germination. Pour le test de germination du tabac, 24 graines par boîte de Petri ont été semées sur un milieu gélosé contenant 200 μM de KAND ou de DMSO. Les graines de tabac ont été cultivées en chambre de culture et le nombre de plantules germées a été compté après 14 jours. Pour le test d'inhibition de la croissance des hépatiques, 9 embryons de chaque plaque ont été déposés sur un milieu gélosé contenant les concentrations indiquées de KAND ou de DMSO et incubés dans une chambre de croissance pendant 14 jours.
Des plantules colorées avec 5 mg/ml d'iodure de propidium (PI) ont été utilisées pour visualiser l'organisation du méristème racinaire. Les signaux PI ont été observés par microscopie à fluorescence à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser TCS SPE (Leica Microsystems).
La coloration histochimique des racines à la β-glucuronidase (GUS) a été réalisée selon le protocole décrit par Malami et Benfey36. Les plantules ont été fixées dans de l'acétone à 90 % pendant une nuit, colorées avec une solution de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronique (0,5 mg/ml) dans un tampon GUS pendant 1 heure, puis placées dans une solution de chloraldéhyde hydraté (8 g d'hydrate de chloral, 2 ml d'eau et 1 ml de glycérol) et observées par microscopie à contraste interférentiel différentiel à l'aide d'un microscope Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Les angles racinaires ont été mesurés sur des plantules âgées de 7 jours, cultivées sur des plaques verticales. Mesurez l'angle de la racine par rapport à la direction du vecteur de gravité, comme décrit à l'étape 6.
L'organisation des microtubules corticaux a été observée selon la méthode décrite, avec quelques modifications mineures du protocole37. L'anticorps anti-β-tubuline (KMX-1, Merck Millipore : MAB3408) et l'IgG anti-souris conjuguée à l'Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific : A32723) ont été utilisés comme anticorps primaire et secondaire, aux dilutions respectives de 1/1000 et 1/100. Les images de fluorescence ont été acquises à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser TCS SPE (Leica Microsystems). Les images de la pile Z ont été acquises et les projections d'intensité maximale ont été créées conformément aux instructions du fabricant.
Le test de prolifération des cellules HeLa a été réalisé à l'aide du kit de comptage cellulaire 8 (Dojindo) selon les instructions du fabricant.
La croissance d'E. coli DH5α a été analysée en mesurant la densité cellulaire en culture à l'aide d'un spectrophotomètre à 600 nm (OD600).
L’organisation du cytosquelette dans les cellules BY-2 transgéniques a été observée à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un système de balayage confocal CSU-X1 (Yokogawa) et d’une caméra sCMOS (Zyla, Andor Technology). La densité du cytosquelette a été évaluée par analyse d’images, qui a quantifié le pourcentage de pixels cytosquelettiques parmi les pixels cytoplasmiques dans les images confocales à l’aide du logiciel ImageJ, comme décrit précédemment38,39.
Pour détecter la mort cellulaire dans les cellules BY-2, un aliquot de la suspension cellulaire a été incubé avec du bleu d'Evans à 0,05 % pendant 10 minutes à température ambiante. La coloration sélective des cellules mortes par le bleu d'Evans repose sur l'extrusion du colorant des cellules viables par la membrane plasmique intacte40. Les cellules colorées ont été observées à l'aide d'un microscope à fond clair (BX53, Olympus).
Les cellules HeLa ont été cultivées dans du DMEM supplémenté avec 10 % de FBS dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO₂. Elles ont été traitées avec 100 μM de KAND 11, d'acide kumamonamique 6, de kumamonamide 1, 100 ng/ml de colcémide (Gibco) ou 100 ng/ml de Nocodmaze (Sigma) pendant 6 h à 37 °C. Les cellules ont été fixées avec du méthanol pendant 10 min, puis avec de l'acétate pendant 5 min à température ambiante. Les cellules fixées ont été incubées avec un anticorps primaire anti-β-tubuline (1D4A4, Proteintech : 66240-1) dilué dans du PBS contenant 0,5 % de BSA pendant 2 heures, lavées 3 fois avec du TBST, puis incubées avec un anticorps secondaire de chèvre conjugué à l'Alexa Fluor pendant 1 heure. – IgG de souris (Thermo Fisher Scientific : A11001) et 15 ng/ml de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dilués dans du PBS contenant 0,5 % de BSA. Après trois lavages au TBST, les cellules marquées ont été observées au microscope inversé Nikon Eclipse Ti-E. Les images ont été acquises à l’aide d’une caméra CCD refroidie Hamamatsu ORCA-R2 et du logiciel MetaMorph (Molecular Devices).
Date de publication : 17 juin 2024